苏州市工业园区市售阿胶类保健品基于PCR技术的检测结果分析

付群 张玲 庞幸 刘岩 韩蓉 杨嫣骊

作者简介：付群（1987—），男，江西樟树人，硕士。研究方向：公共卫生、食品安全。

通信作者：杨嫣骊（1990—），女，江苏苏州人，本科。研究方向：药品安全。E-mail： yangyanli@sipac.gov.cn。

摘 要：阿胶因其独有的药用价值在食品、药品等领域中被广泛应用。市场上的阿胶类产品良莠不齐，市场监管辨别真伪及掺假的手段多为国家药典的标准方法液相色谱-质谱联用法，但该方法样品处理复杂、检测成本高、检测灵敏度不足且易产生假阳性结果。本研究对分布于苏州市工业园区的多家药店的阿胶类产品进行随机取样，用PCR检测技术对其动物源性成分进行检测和分析，为市场监管提供新的参考及思路。

关键词：阿胶；动物源性成分；PCR技术；线粒体DNA

Analysis of PCR-Based Detection Results of Donkey-Hide Gelatin Health Products Sold in Suzhou Industrial Park

FU Qun1， ZHANG Ling2， PANG Xing1， LIU Yan3， HAN Rong4， YANG Yanli1*

（1.Suzhou Industrial Park Food and Drug Safety Inspection Unit， Suzhou 215000， China; 2.Suzhou Institute for Food Control， Suzhou 215000， China; 3.College of Pharmaceutical Sciences， Soochow University， Suzhou 215000， China; 4.Suzhou Prem Biotechnology Co.， Ltd.， Suzhou 215000， China）

Abstract： Donkey-hide gelatin is widely used in the fields of food and medicine because of its unique medicinal value. The ass hide glue products on the market are good and bad， most of the methods for market supervision to distinguish authenticity and adulteration are liquid chromatography-mass spectrometry， which is the standard method of national pharmacopoeia， but this method has some disadvantages， such as complex sample processing， high detection cost， low detection sensitivity and easy to produce false positive results. In this study， samples of donkey-hide products were collected from a number of pharmacies randomly distributed in Suzhou Industrial Park. The animal-derived ingredients of donkey-hide products were detected and analyzed by PCR， which provided provide new reference and train of thought for market supervision.

Keywords： donkey-hide gelatin; animal-derived ingredients; PCR technology; mitochondrial DNA

阿膠是一种由马科动物驴的皮熬制而成，具有药用价值的滋补品。近年来，随着食品卫生健康规范的不断改革，阿胶也逐渐从药用方向转向保健、食疗等诸多方向。目前，市场上有药用型阿胶生产批文的企业有数十家，有食用阿胶生产资质的企业数量更多，致使阿胶市场异常混乱。随着市场对阿胶需求量的不断增加，驴皮供不应求，导致阿胶成本上涨。许多企业为了追求利益，在熬制阿胶的过程中掺入猪、牛、羊和马等价格低廉的动物皮冒充驴皮，致使阿胶的药用功效降低。

为了整顿阿胶市场，国家先后出台了多种检测标准，如《阿胶补血口服液中牛皮源成分检查项补充检验方法》（BJY 201805）、《阿胶补血膏中牛皮源成分检查项补充检验方法》（BJY 201804）等，以上标准检验方法及目前中国药典2020版均采用液相色谱-质谱联用技术为检测手段，以液相色谱为分离系统，质谱为检测系统，通过不同物种的特征肽鉴别阿胶产品的动物源性[1-2]。该技术所需的质谱仪多为国外进口，价格昂贵，且需配套的高效液相色谱仪、氮气（发生器）、不间断电源、样本前处理装置（离心机、氮吹仪、固相萃取装置、通风柜等）以及独立、通风、室温和湿度合适的实验室空间，增加了实验室的运行维护成本。基于PCR技术的分子生物学技术目前已被应用于动物源性的鉴定，如食品检测中的肉源掺假检测、动物源中药材等。本研究采用多重PCR检测方法（专利号：201810482987.3；201810016749.3），以牛、羊、猪、马、驴、鸡、鸭、狗、鼠、狐狸和兔这11种肉源线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）为检测靶基因[3-4]，对分布于苏州市工业园区的50家药店在售的56个阿胶类商品随机取样并进行多重筛查检测，对筛查结果阳性的样品通过单重PCR的国标或专利方法进行进一步复检确认。本文研究了目前市场上阿胶产品质量状况及常见掺假肉源种类，为市场监管部门提供新的检测方法和监管思路。

1 材料与方法

1.1 仪器

普通聚合酶链式反应（PCR）仪，杭州朗基科学仪器有限公司；凝胶成像仪，杭州朗基科学仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器场；Nanodrop 2000/2000C分光光度计，Thermo scientific公司；微量移液器，德国Eppendorf公司。

1.2 试剂

DNA提取试剂（PCR级柱式动物线粒体DNAout）盒，天恩泽基因科技有限公司；TAE（50×）凝胶电泳液，BioSharp公司；琼脂糖，BIOWEST维百奥生物科技公司；本研究所用引物均购自GENEWIZ生物科技有限公司；DreamTaq Green PCR Master Mix、GeneRuler 100 bp DNA ladder及DNA loading Dye，Thermo Scientific公司；SuperRed/GelRed核酸染料，BioSharp公司；PBS溶液，HyClone公司。

1.3 抽检样品

本次抽检的阿胶制品分别来自苏州市工业园区中金鸡湖商务区、独墅湖科创区、阳澄湖度假区以及高端贸易制造区的50家药店，共计56份阿胶产品，其中口服液制品8例，胶浆制品11例，其余均为固态颗粒、片剂、板状和膏制品。

1.4 样品前处理与核酸提取

块状样品：取1 g样品，研磨成粉末状，放入离心管，加入600 μL PBS缓冲液，60 ℃水浴30 min，12 000 r·min-1离心1 min，吸取上清1 μL作为PCR模板。颗粒状样品：取1 g样品放入离心管，加入600 μL PBS缓冲液，60 ℃水浴30 min，12 000 r·min-1离心1 min，吸取上清1 μL作为PCR模板。阿胶浆、口服液类样品：取2个2 mL离心管，每管中分别加入1.5 mL样品，12 000 r·min-1离心1 min。将上清液转移至吸附柱并离心，废弃收集管中液体，重复多次，直至3 mL样品全部经吸附柱处理。将吸附柱置于1.5 mL离心管中，加入50 μL 65～80 ℃预热的TE洗脱液进行洗脱，室温放置2 min，12 000 r·min-1离心1 min，管底沉淀即为提取的核酸。

1.5 多重PCR体系对阿胶产品中的肉源筛查

本研究采用前期构建的多重PCR方法对阿胶进行初筛，该多重PCR方法由四重PCR和八重PCR双联合多重体系组成，可以检测样品中是否含有牛、羊、猪、马、驴、鸡、鸭、狗、鼠、狐狸和兔共

11种肉源性成分，具体引物及检测方法等参照文献内容[3-4]。多重PCR检测是为了筛选出除驴以外的肉源成分，再采用单重PCR检测进一步验证。

2 结果与分析

2.1 单重PCR验证

對样品中出现牛、羊、猪、马和驴5种动物源阿胶产品，通过单重PCR国家标准方法及相关专利方法对检测结果进一步验证，其中，猪、牛、羊按照《肉类罐头中牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分检测方法PCR法》（QB/T 5505—2020）进行测定。由于阿胶加工过程中核酸的分解导致核酸浓度大幅降低，单重PCR验证阶段对所有样品均进行两轮PCR反应，第1轮PCR旨在放大样品核酸中靶标DNA序列分子，经电泳分析筛选出部分动物源性DNA载量较大的样品，然后以第1轮的PCR产物为模板对此轮未检出条带的样品继续进行第2轮PCR反应，第2轮反应结束后再进行电泳凝胶结果分析，具体引物及产物如表1所示，相关PCR反应程序如表2～表5所示。

2.2 样品检测结果

56份检测样品中，10份样品检测结果低于最低检测限，未能检出常见肉源成分，占样品总量17.8%；10份样品检出了驴源性成分，其中仅1份样品为单一的驴源性成分；其余36份样品均未检出驴源性成分。9份样品不仅检出了驴源性成分，还检出了牛、马、猪和羊中的1种或多种肉源成分，占样品总量16.1%。36份样品检出了牛、马、猪、羊中的

1种或多种肉源成分，占样品总量64.3%。本研究中首先采用多重PCR方法检测样品中是否含有牛、羊、猪、马、驴、鸡、鸭、狗、鼠、狐狸和兔共11种肉源性成分[3-4]，采用多重PCR技术是为了高效筛选出样品中是否含有除驴以外的肉源成分，多重PCR扩增产物通过凝胶电泳中电泳条带的大小判断肉源种类，图1为部分样品多重PCR电泳结果。为进一步验证多重PCR检测结果，再采用《肉类罐头中牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分检测方法 PCR法》（QB/T 5505—2020）中单重PCR检测方法进一步验证多重PICR检测结果，单重验证PCR代表性电泳结果如图2所示，检测结果统计分析如表6～表8所示。

泳道M是100 bp GeneRuler，0是阴性对照，1或2为样品检测结果。图A泳道1～2为牛；图B泳道1中的两个条带为猪和牛；图C为猪；图D泳道1～2为驴；图E为马/马骡。

3 结论

阿胶是市场上常见的动物源中药，中国药典规定阿胶必须由驴皮熬制而成。阿胶在加工过程中要经历高温熬制等一系列加工步骤，导致阿胶中DNA含量大幅降低[6]。本研究基于3方面的考虑选择了靶基因为mtDNA的PCR检测方法：mtDNA基因包含不同物种之间的高DNA变异和同一物种个体之间的低DNA变异，可区分肉类物种[7]；肌肉中线粒体拷贝数高，如单个骨骼肌细胞中约有3 500个线粒体拷贝数[8]；线粒体为环状闭合DNA，不易被破坏[9]。因此基于mtDNA的PCR检测可有效提高样品的检出率。

为了全面了解目前阿胶产品可能出现的掺假动物源，本研究首先选用了“公共引物”介导的多重PCR技术，以狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔子、鼠、鸭、羊这11种肉源的线粒体DNA作为检测靶标，对56个检测样品进行初筛。多重PCR方法可一次性鉴别多种目标成分，与传统的单重PCR方法相比，极大地节约了检测时间和实验试剂，降低了检测成本。为进一步确认多重PCR检测结果，通过单重PCR的国标或专利方法对初筛阳性样品进行第2轮复检。检测结果显示，56份阿胶样品中有

45份检出牛、猪、羊、马/马骡1种或多种其他动物源性成分，主要是牛和猪，其次为羊和马/马骡。由于检测靶标为mtDNA，本研究采用的检测方法不能对马和马骡进行区分。此外，本研究56个样品中，有10个样品未能有效检出动物源性成分，表明阿胶制作过程中的DNA降解会使以DNA为靶标的相关分子检测方法受到限制。

目前，《中华人民共和国药典》2020年版采用液相色谱-质谱联用法作为阿胶中动物源性成分检测的主要手段。其检测对象为不同物种的特征肽，在动物源性的检测中需要参比物进行峰形对照[10]。而PCR类检测方法则直接从DNA序列入手，通过特异引物对各物种特异性的一段序列大量扩增，检测灵敏度高于液质联用技术，且无须参比物进行对照，排除了外源假阳性尤其是驴动物源性的可能。因此，两种分别基于特征肽和DNA的检测方法的检测结果可以相互印证。虽然基于PCR技术的分子生物学技术可应用于动物源中药材的种属鉴定，但针对DNA序列的PCR类检测方法尚无阿胶产品动物源掺假的法定检测方法，本研究结果仍需进一步采用液相色谱-质谱联用方法进行确认。建议将用于食品肉源鉴定PCR国家标准方法纳入阿胶产品法定检测方法的补充，打击阿胶产品掺假行为，维护消费者的利益。

参考文献

[1]中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部（2020年版）[M].北京：中國医药科技出版社，2020.

[2]邵清松，胡润淮.高效液相色谱-质谱联用技术在中药研究中的应用[J].中医药学报，2007（3）：44-47.

[3]LIU W，TAO J，XUE M，et al.A multiplex PCR method mediated by universal primers for the identification of eight meat ingredients in food products[J].European Food Research and

Technology，2019，245（11）：2385-2392.

[4]LIU W W，WANG X N，TAO J，et al.A Multiplex PCR assay mediated by universal primers for the detection of adulterated meat in mutton[J].Journal of Food Protection，2019，82（2）：325-330.

[5]陈思秀，张馨方，刘玟妍，等.阿胶中动物源性DNA提取方法的改进及驴源性成分鉴定[J].中国药学杂志，2019，54（22）：1840-1845.

[6]刘艳艳，董书光，耿加亮，等.阿胶加工工艺过程中DNA降解规律研究[J].药学研究，2016，35（9）：501-507.

[7]TSAOUSIS A D，MARTIN D P，LADOUKAKIS E D，et al.Widespread recombination in published animal mtDNA sequences[J].Molecular Biology & Evolution，2005，22（4）：925-933.

[8]FRITZEN M A，TH?GERSEN B F，THYBO K，

et al.Adaptations in mitochondrial enzymatic activity occurs independent of genomic dosage in response to aerobic exercise training and deconditioning in human skeletal muscle[J].Cells，2019，8（3）：237.

[9]NAINI A，GILKERSON R，SHANSKE S，et al.Detection of mitochondrial DNA （mtDNA） mutations[J].Methods in Cell Biology， 2020，15：383-400.

[10]沙小梅，张丽君，蒋文丽，等.高效液相色谱-高分辨率质谱联用技术鉴定阿胶块中不同胶类的特征性多肽[J].食品工业科技，2022，43（4）：97-104.