小鼠小肠类器官炎症模型的构建

陈浩，李蕊，易菲，周丽，陈嘉琪，朱璠，管城艳，吴娜，5△

类器官技术已经实现了各种类型的上皮细胞体外自我更新，同时自组装成类似于其亲本组织的3D结构，它成功复刻了原始组织的体内结构、功能和遗传特征，在研究器官发育、生物学和病理生理学方面，类器官代表了一种比传统细胞培养更具有生理相关性的体外模型，同时也为临床提供器官移植供体的替代疗法带来了巨大潜能［1］。人源类器官的新进展使得疾病建模更加精确，现已应用于炎症［2］、感染［3］、代谢［4-5］和肿瘤［6］等疾病的研究。模拟疾病的类器官可用作药物测试的替代系统，既能测试药物的效力和毒性，又能更好地诠释临床疗效［7］。相对于传统的动物模型，类器官技术可用于模拟多种不易或者无法在动物体内模拟的神经发育障碍、肝脏代谢障碍和退行性疾病等，显著减少了用于药物毒性和功效测试的动物研究［8-9］。为进一步探究炎症与肠道疾病的关系，本实验构建了小鼠小肠类器官并以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导，旨在建立合适的以体外类器官为基础的肠损伤炎症模型，为肠道医学研究和临床新疗法的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级6～8 周龄雄性C57BL/6 小鼠6 只，体质量18～22 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司［动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010］，饲养环境的温度约24 ℃，相对湿度为40%～70%。动物饲养、实验操作均在江西中医药大学进行［动物使用许可证号：SYXK（赣）2022-0002］。

1.2 试剂与仪器 LPS 购自Sigma-Aldrich 公司；不含Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液（DPBS）购自Biosharp；上皮类器官基础培养基、类器官基质胶（organoid culture ECM）、乙二胺四乙酸（EDTA）、小肠类器官完全培养基（在DMEM/F12培养基中添加N-乙酰半胱氨酸、B+补充剂、GlutaMAX、60 U/mL 青霉素、0.1 g/L 链霉素、5 µg/L EGF、250 µg/L R-spondin-1、100 µg/L Noggin、500 nmol/L A83-01、5µmol/L Y-27632和5 mmol/L 烟酰胺）均购自伯桢生物（bioGenous）；24、48、96孔板购自兰杰柯生物科技有限公司；70µm细胞过滤器购自比克曼生物科技有限公司；CCK-8 检测试剂盒购自美仑生物技术有限公司；倒置显微镜购自徕卡显微系统（上海）贸易有限公司；CO2恒温细胞培养箱购自上海润度生物科技有限公司；台式低速离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司；超净工作台购自力康精密科技（上海）有限公司；酶标仪购自美国赛默飞公司；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素（IL）-1α、IL-6、IL-10酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自江苏酶免生物科技有限公司。

1.3 小鼠小肠隐窝分离与小肠类器官原代培养 腹腔麻醉后采取颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下开腹取15 cm 左右的小肠组织，放入预冷的DPBS中清洗，去除小肠外层的薄膜和周围的脂肪组织。沿长轴将小肠剪开，在DPBS 中清洗小肠内容物后将小肠分成5～8 cm若干段。用载玻片轻轻刮去肠腔表面的肠绒毛，将清洗后的小肠组织剪至3 mm 的组织碎片，用预冷的DPBS 清洗后将组织碎片转移到15 mL 含5 mmol/L EDTA 的冷DPBS 中，在4 ℃冰箱中消化20 min。将消化好的小肠碎片转移至50 mL 离心管中，加入25 mL DPBS，上下适当摇晃（切记不要剧烈摇晃以避免破坏隐窝结构，力度不要过轻以免隐窝摇不下来），使隐窝与基底层分离，用70 µm 的细胞过滤器过滤混悬液。将滤液经过室温300×g离心5 min，吸去上清液后，加入1 mL基础培养基重新吹打重悬沉淀，吸取适量隐窝悬液通过显微镜观察隐窝形态并计数（最佳隐窝数量为5～10 个/µL）。再经室温300×g离心5 min，去除上清液。将事先在冰上预冷的基质胶重悬细胞沉淀，取出提前放入37 ℃细胞培养箱中预热的24孔板，吸取基质胶-隐窝混合悬液，先滴在培养孔底部中央位置，再以画圈的方式往周围铺开形成穹顶状进行接种（30µL/孔）。接种后将培养板放入细胞培养箱（5%CO2、37 ℃）15～20 min，待基质胶完全固化后，加入500µL完全培养基，剩余空白孔加入500µL无菌DPBS，以保证培养板的湿化。将24孔板放入细胞培养箱（5%CO2、37 ℃）中继续培养，每天观察生长状态，培养期间每周更换完全培养基3次，5～7 d进行传代。

1.4 小肠类器官的传代培养 培养5～7 d或类器官中央区域变黑时进行传代。吸去待传代孔中的培养液，每孔加入预冷的500µL基础培养基，用移液枪吹打30～50次，避免产生气泡，将孔中的基质胶和类器官吹散。将混悬液转移至1.5 mL离心管中，室温300×g离心5 min，弃去上清液，取出提前放入细胞培养箱中预热的24孔板，将基质胶与小肠隐窝细胞团混匀成混悬液，接种到24 孔板中，放于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养15～20 min，待基质胶自然凝固后，每孔再加500µL完全培养基，放置于细胞培养箱中继续培养。

1.5 建立体外小肠类器官炎症模型并行增殖活力测定 参照文献［10］构建炎症模型的方法并适当改进，通过LPS处理小肠类器官，建立体外小肠类器官炎症模型，筛选LPS 的适宜浓度和作用时间。将传代后的小肠类器官接种到96孔板中进行培养，当类器官生长汇合度达到50%以上或培养3 d时，弃去旧培养基，使用完全培养基配制0、150、175、200、225、250、275、300 mg/L LPS，分别置于相应孔中，放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱中分别孵育24 h和48 h，在倒置显微镜下观察并拍照记录LPS 诱导炎症后小肠类器官的生长及形态特征变化。每孔加入10µL CCK-8 溶液，放于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中继续孵育2 h，使用酶标仪在450 nm 波长下检测各孔的光密度（OD）值，以检测小肠类器官增殖活力。

1.6 ELISA 法检测IL-1α、IL-6、IL-10、GM-CSF 的水平 分别收集LPS 作用24 h 和48 h 后的类器官培养上清液并储存在-80 ℃，根据上述形态学观察和CCK-8检测的增殖活力结果综合筛选出4 个质量浓度LPS 行进一步的炎性因子检测。按照ELISA试剂盒说明书中的操作方法进行处理，在450 nm波长处测量各孔的OD 值，绘制标准曲线计算IL-1α、IL-6、IL-10、GM-CSF炎性因子的浓度。

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠小肠类器官体外培养体系的建立 接种在24孔板后，新分离的成活小肠隐窝呈现U型发夹样结构。培养数小时至1 d 内开始自动闭合形成轮廓较清晰的囊状圆球体结构，中心有单个内腔。培养2～3 d 可见圆球状结构逐渐变大，内部开始呈现类似肠腔的中空结构。小肠干细胞在不断进行自我更新和复制，第4 天可观察到圆球状结构外侧周围开始出现出芽并向外突出生长。随着培养时间的增加，出芽数量逐渐增多，管腔结构更加明显，管腔壁也明显增厚，形成小肠类器官。第5 天逐渐形成围绕中央管腔周围的类似花环状结构，管腔中央有脱落的细胞开始出现凋亡，颜色变深，此时要尽快完成传代。传代后的小肠类器官被切割成了小肠类器官碎片，随着培养时间的增加，传代培养3 d 会重新长成成熟的小肠类器官结构，此时的小肠类器官可用于进行后续实验。见图1。

Fig.1 Changes of growth morphology of small intestinal organs in mice after primary and post-passage图1 小鼠小肠类器官原代及传代后的生长形态变化

2.2 不同时间和质量浓度LPS 对小肠类器官生长和分化状态的影响 随着LPS质量浓度和时间的增加，小肠类器官有不同程度膨胀趋势和内腔逐渐呈黑色凋亡状态，受损的肠上皮中隐窝或肠干细胞的增殖分化能力和出芽数量也受到不同程度的抑制。与0 mg/L LPS 作用24 h 和48 h 相比，不同质量浓度LPS对诱导不同时间的小肠类器官的生长出现不同程度的抑制作用。其中175、200、225、250和275 mg/L LPS在24 h和48 h作用下膨胀程度和48 h内腔凋亡状态最为明显，但150 mg/L 和300 mg/L LPS 作用后膨胀趋势不明显。见图2。

Fig.2 Effects of different time points and concentrations of LPS on the growth and differentiation of intestinal organoids图2 不同时间和质量浓度LPS对小肠类器官生长和分化状态的影响

2.3 不同时间和质量浓度LPS 对小肠类器官增殖活力的影响 与0 mg/L LPS相比，175～300 mg/L LPS诱导小肠类器官炎症后24 h和48 h增殖活力出现不同程度的降低（P＜0.05），并且175～225 mg/L LPS 诱导小肠类器官炎症后24 h和48 h的细胞活力仍大于50%，见图3，故选择该浓度范围进行后续实验。

Fig.3 Effects of different time points and concentrations of LPS on the proliferation activity of small intestinal organoids图3 不同时间和质量浓度LPS对小肠类器官增殖活力的影响

2.4 不同质量浓度LPS 诱导对小肠类器官GMCSF、IL-1α、IL-6、IL-10 水平的影响 小肠类器官在给予0、175、200和225 mg/L LPS诱导后，与0 mg/L LPS 相比，200 mg/L 的LPS 诱导24 h后，IL-1α和IL-6 水平升高，IL-10 水平降低（P＜0.05）；200 mg/L 的LPS诱导48 h后，GM-CSF水平升高，IL-10水平降低（P＜0.05）；225 mg/L 的LPS 诱导24 h 后，IL-6 水平升高（P＜0.05）；225 mg/L 的LPS 诱导48 h 后，IL-1α、IL-6、GM-CSF水平升高（P＜0.05），见图4。

Fig.4 The expression of inflammatory factors in small intestinal organoids treated by four concentrations of LPS图4 4种质量浓度LPS对小肠类器官炎性因子水平的表达

3 讨论

脓毒症是一种复杂且动态变化的综合性疾病，其早期会由于肠道的缺血、缺氧引起肠道组织和细胞发生氧化应激损伤、肠功能障碍，导致肠道内毒素、细菌等侵入体内，引起大量炎性因子的释放与分泌［11］。LPS 是革兰阴性菌细胞壁衍生的炎症毒素，其在免疫细胞激活的情况下，将导致多效性炎性细胞因子和趋化因子分泌，引起一系列炎症反应。由于LPS 具有良好的热稳定性和广泛的毒性反应，因此在与炎症相关的研究中得到广泛应用［12］。在正常生理情况下，肠道上皮细胞通过促进营养物质、水和离子的跨细胞运动来保持适当的屏障功能，同时减少细菌或其产物进入系统循环的细胞旁运输［13］。但在肠道通透性障碍中，紧密连接屏障缺陷可使LPS和其他炎性管腔抗原细胞旁通量增加，LPS 通过刺激Toll 样受体导致细胞内核转录因子κB 的重新激活，随后释放化学因子和炎性细胞因子，促进大量促炎因子如IL-1α、IL-6、GM-CSF的产生和释放，抑制抗炎因子IL-10、IL-11 的产生和释放，最终导致细胞坏死或凋亡，诱发全身性炎症反应的发生发展［14-15］。以往研究表明，炎性因子的产生能够对肠上皮细胞的增殖与分化等方面产生影响，如在小鼠小肠体外模型中，IL-6 能够增加小肠中增殖细胞和干细胞数量，可显著促进肠上皮细胞的增殖［16］。这种促炎因子的持续升高会使肠道炎症难以消退，并且肠上皮的自我更新能力失调导致肠上皮损伤，进而引发一系列炎症反应。本实验成功分离出了小肠隐窝，在体外培养成了类器官，用于模拟各种肠道疾病的研究。笔者进一步采用不同质量浓度LPS分别作用24 h 和48 h 后，小肠类器官形态出现不同程度的膨胀和内腔变黑的凋亡现象，其中175、200、225、250 和275 mg/L LPS 在24 h 和48 h 作用下形态学变化相对明显。本研究结果表明，200或225 mg/L LPS可能是诱导小肠类器官炎症的适宜浓度。有学者以200 mg/L LPS 进行类器官诱导炎症的体外实验［17］，本研究结果也进一步证明了其可行性。需注意的是，不同炎性因子之间存在不同的分泌峰值的情况，这可能是因为TLR 受体亚型活化结果的不同所导致，也可能是因为细胞因子本身通过正反馈或负反馈来调节旁分泌，从而导致其他炎性因子分泌增加或减少［18］。本研究构建的小肠类器官经LPS处理后符合肠上皮生长受限、屏障功能受损以及炎症反应增强等肠上皮损伤模型的标准，但在体外-体内相关性方面，仍需进行进一步的实验研究，以充分了解LPS诱导的小肠炎症系统的原理及其限制。

肠损伤炎症模型的建立有望弥补目前的抗炎或免疫抑制等治疗策略难以克服异质性、多因素的炎症性肠病的缺陷，体外构建炎症模型的类器官代表了针对肠上皮功能障碍的炎症性肠病建模的有效工具［19-20］。肠干细胞衍生的类器官在长期培养期间，其遗传、表观遗传和表型趋于稳定，对肠道疾病的发病机制研究具有重要意义［21］。目前人类疾病的治疗存在患者个体差异大和个性化疗效难以预测等局限性，而基于特定个体的3D类器官培养物有望发展成精准医疗的有力工具［22］。在初始体外筛选中建立仿生平台以预测候选药物的效力将极大降低高昂的研发成本，为药物筛选和开发靶向疗法提供了新型的有效平台。