超声辅助提取-LC-MS/MS法测定猪肉中9种β-受体激动剂

闫顺华 马 君 苏比努尔

（新疆维吾尔自治区药品检验研究院，乌鲁木齐 830054）

1 前言

β-受体激动剂是一组苯乙醇胺化合物，常被用作支气管扩张剂和抗宫缩剂[1，2]，大剂量用在饲料中可以提高动物的生长速度，减少动物体内的脂肪比例，提高瘦肉率[3，4]。β-受体激动剂会在动物肌肉和内脏中残留，消费者长期食用，会造成肌肉抽搐、心脏病、中枢神经疾病甚至诱发恶性肿瘤[5-7]。由于其严重的危害性，欧盟和中国已经禁止在饲料中添加这类化合物[8-10]。

目前现行有效的检测食品中β-受体激动剂的国家标准主要有GB 31658.22-2022《食品安全国家标准 动物性食品中β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[11]、SN/T 1924-2011《 进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》[12]和农业部1025号公告-18-2008《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法》[13]，在这3个标准中，β-受体激动剂的检测都需要酶解步骤，均采用37℃酶解16h的方式把与蛋白结合的目标化合物释放出来[12，13]。由于酶解时间长、前处理方法繁琐，费时费力，难以满足大批量样品快速且准确的分析需求。

本研究对样品前处理方法进行了改进，用乙腈饱和的正己烷除去样品中的脂肪，用1%乙酸-乙腈溶液作为提取液对猪肉样品进行超声提取，将提取液氮吹至近干，用0.1%甲酸水复溶后进行测定，方法回收率在70%以上。该样品前处理方法操作简单，样品提取效率高，既缩短了检验时间、又节约了成本（β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶价格昂贵）、大大提高了工作效率。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱-质谱联用仪：I-Class/Xevo TQS, 美国Waters公司；电子天平：百分之一，Mettler Toledo公司；组织绞碎机：B-400型，瑞士步琦公司；离心机：SIGMA 1-14型，德国 Sigma 公司；多用途恒温超声仪：BASIC550型，德国Elma公司；氮吹仪：Eva50a型，北京普立泰科仪器有限公司。

β-受体激动剂混合标准溶液：100 μg/mL，批号-S084895，FirstStandard；克伦特罗-D9:100 μg/mL，批号-S074679，FirstStandard；沙丁胺醇-D3：100 μg/mL，批号-S074701，FirstStandard；盐酸莱克多巴胺-D3：100 μg/mL，批号-S070751，FirstStandard；

乙腈和甲酸：色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；正己烷：色谱纯，TEDIA COMPANY，INC；乙酸和乙腈：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司。

猪肉粉中克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林分析质控样品：北京美正检测技术有限公司。

2.2 样品处理

2.2.1 样品预处理

取样品适量，切成小块，置组织绞碎机中绞成肉糜，分装至200mL的样本袋中，贴样品状态标签，密封后冷冻保存。

2.2.2 样品制备

称取2克样品，置于50mL塑料离心管中，加入1000ng/mL的沙丁胺醇-D3、莱克多巴胺-D3、克伦特罗-D9 3种内标混合溶液10μL，混匀，加入10mL1%乙酸-乙腈溶液，加入5～10mL经乙腈饱和的正己烷，涡旋混匀，超声提取15min，涡旋混匀，8000r/min离心5min，准确移取10mL乙腈层在40℃氮吹浓缩至近干，加入2.0mL0.1%甲酸水溶液，涡旋混匀，过0.22μm水系滤膜，上机待测。

其中沙丁胺醇-D3作为沙丁胺醇、特布他林的内标物、莱克多巴胺-D3作为莱克多巴胺的内标物[16]、克伦特罗-D9作为其余β-受体激动剂的内标物，

2.2.3 方法检出限、定量限制备

称取2份阴性样品2g（精确至0.01g）置于两个三角烧瓶中，分别精密加入10ng/mL外标混合溶液40μL、100μL，同时各加入1000ng/mL内标混合溶液10μL，混匀，按样品制备方法同法处理。

2.2.4 加标样品制备

称取阴性样品2g（精确至0.01g）各置于三角烧瓶中，分别精密加入100ng/mL的9种β-受体激动剂外标混合溶液10μL、50μL、1000ng/mL外标混合溶液40μL，同时各加入1000ng/mL内标混合溶液10μL，混匀，按样品制备方法同法处理。

2.2.5 质控样品处理

称取2g质控样品（精确至0.01g），加入1000ng/mL内标混合溶液10μL，按样品制备方法同法处理。

2.3 标准溶液配制

2.3.1 标准储备液配制

精密量取0.1mLβ-受体激动剂混合标准溶液至1 0 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到浓度为1000ng/mL的标准储备液。

分别精密量取3种内标标准溶液各0.10mL至同一10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到浓度为1000ng/mL的混合内标储备液。

2.3.2 标准中间液配制

精密量取1000ng/mL的外标混合溶液0.20mL至10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到浓度为20ng/mL的外标混合标准中间液。

2.3.3 混合标准工作液系列配制

分别精密量取不同体积的外标混合标准中间液至6个10mL容量瓶，再分别精密加入1000ng/mL内标混合溶液0.05mL，然后再用甲醇定容至刻度，得到外标浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL和内标浓度均为5.0ng/mL的标准工作液系列。

2.4 液质联用仪工作条件

色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18，(2.1×100mm,1.7μm) ；流动相： 0.1%甲酸/水（A相）+0.1%甲酸/乙腈（B相），梯度洗脱条件见表1；流速：0.3mL/min；电离模式：ESI；扫描方式：正离子扫描；检测方式：MRM ，质谱条件见表2；进样量：5.0μL 。

表1 梯度洗脱条件

表2 9种-受体激动剂质谱条件

2.5 9种-受体激动剂总离子流图（图1）

图1 9种-受体激动剂总离子流图

3 结果分析与讨论

3.1 线性方程、方法检出限和定量限

用LC-MS/MS对2.3.3项下的混合标准工作液系列进行测定，每个浓度重复测定2次。以相对应的响应值为纵坐标（y），以标准工作液的浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，计算回归方程。

对2.2.3项下方法检出限样品进行测定，9种β-受体激动剂的信噪比均大于3，则9种β-受体激动剂的检出限为：=0.2ng/g=0.2μg/kg。对2.2.3项下方法定量限样品进行测定，9种β-受体激动剂的信噪比均大于10，则9种β-受体激动剂的定最限为：种β-受体激动剂的标准曲线方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限的测定结果见表3。

表3 9种β-受体激动剂的标曲方程、相关系数、检出限和定量限

从表3可以看出，9种β-受体激动剂在一定范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.996，检出限均为0.2μg/kg，定量限均为0.5μg/kg。本研究中的方法检出限和定量限与国家标准GB 31658.22-2022是一致的，说明本研究建立的方法能够满足国标GB 31658.22-2022的要求。

实验中发现个别β-受体激动剂比较容易残留，因此标准曲线最高点的浓度不易配制过大，且应注意走完标准曲线后应多进几针空白以降低或消除残留。

3.2 方法回收率

对2.2.4项下低、中、高加标样品进行测定，回收率结果如表4所示。

表4 9种β-受体激动剂加标回收率（n=6）

按照GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[14]中的质量控制要求，当被测组分含量小于0.1μg/mL(即小于100ng/mL)时，回收率应在60%～120%的范围内。表4中9种β-受体激动剂低、中、高的回收率在70.3%～100.1%之间，符合要求。本方法在样品前处理时，在样品中加入经乙腈饱和的正己烷是为了除脂，并显著减少脂质和脂肪酸引起的离子抑制效应[15]。

按照GB 31658.22-2022的方法制备样品，由于样品前处理较复杂且受到所使用的MCX阳离交换柱的柱效影响，目标组分损失较大，造成加标样品的回收率略低于本研究的回收率。

3.3 样品分析

从2022年的抽检样品中随机抽取10批次猪肉样品，按本研究制定的样品前处理方法制备后进行留样再测，经LC-MS/MS分析，结果表明10批次样品中9种β-受体激动剂均未检出，与按国家标准GB 31658.22-2022进行检测的结果一致。

3.4 质控样分析

对2.2.5项下的质控样品进行测定，带入标曲方程计算，测定结果如表5所示。

表5 4种β-受体激动剂质控样测定结果

按照GB 31658.22-2022的方法处理质控样品，4种β-受体激动剂的测定结果均在满意值范围内；用本研究制定的方法对质控样处理后上机测定，4种β-受体激动剂的测定结果也均在满意值范围内，证明了该样品前处理方法的适用性。在参加中国检科院《猪肉中盐酸克伦特罗的测定》能力验证活动中，实验人员采用本研究制定的方法处理样品后测定，取得了满意结果。

4 结论

本研究建立了一种液质联用仪测定猪肉中9种β-受体激动剂的样品前处理方法，该方法的检出限、定量限和加标回收率均满足相关国家标准要求，质控样的测定值均在满意值范围之内，说明建立的样品前处理方法是可行的。该方法不用酶解，省时省力，大大降低了检测成本，为动物源性食品中β-受体激动剂的检测提供了参考和借鉴。