高效液相色谱法测定慕萨莱思中山梨酸钾的含量

2024-01-15陈盼盼杨凯龙

农产品加工 2023年23期

周环，王凯，陈盼盼，杨凯龙，李璐

（1.塔里木大学食品科学与工程学院，新疆阿拉尔 843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300）

0 引言

慕萨莱思（Musalais），是南疆阿瓦提地区少数民族以鲜食葡萄为主要原料发酵酿制而成的一种酒类饮品，加入枸杞、肉苁蓉、鸽子、雪鸡等辅料，甚至作为烤羊肉等调味料，形成不同风味，不但酒精度较高，且营养价值丰富，其中含有大量的黄酮类物质，18 种氨基酸及十几种微量元素和维生素；此外，还含较多的有机酸（如没食子酸、肉桂酸等）。对于提升睡眠质量、清除瘀血、缓解失眠症状等症状具有一定的功效[1]。如今，慕萨莱思规模化生产步入发展阶段，逐步从家庭作坊式生产向现代化工厂化生产转变，并于2019 年4 月正式加入《新疆维吾尔自治区葡萄酒产业发展规划（2019—2025 年）》，目前阿瓦提县酿造慕萨莱思家庭式作坊400 多家，大型生产工厂10 余家，年产量达5 000 t 以上[2]，在工业化生产时由于其糖浆及成品保藏期较短，易腐败变质。因此，在其生产过程中会加入山梨酸钾作为防腐剂，添加量受到生产者及消费者的关注，准确检测穆萨莱思中山梨酸含量是确保产品质量的关键，只有具有准确检测的方法手段，才能使得这一民族特色产品在新时代中发展更迅速。

山梨酸钾（Potassium Sorbate），也称为2,4 - 己二烯酸钾，是山梨酸的钾盐，是目前最常见的食品防腐剂之一，其作用机制是通过与侵入微生物系统的巯基结合而破坏微生物体的许多酶[3]，使得微生物酶失活，达到防腐延长货架期的目的。因低毒性，所以目前被广泛使用。联合国粮农组织将山梨酸钾现推荐为安全、高效的食品防腐剂，许多发达国家已经把山梨酸钾作为良好、高效的防腐剂，大量地应用于食品中[4]。食品中山梨酸钾的测定方法多样，目前在试验中使用较多的分别为荧光检测法[5-7]、紫外光谱法[8-9]、拉曼特征峰法[10-11]、气相色谱法[12-13]、高效液相色谱法[14-17]等。荧光检测法显色灵敏、回收率高，但易受时间温度影响[9]；紫外光谱法具有操作便捷、结果精准、具有高回收率等优点，但专一性较差，最低检测浓度较高；高效液相色谱法虽然灵敏度与荧光检测法、紫外光谱法相比较低，但是其可以对样品进行前处理，通过净化和富集作用来增加灵敏度，具有专一性强、检测限低、准确率高等特点[15]。近年来，利用高效液相色谱技术检测食品、药品中的化学成分已较为普遍，田莉等人[16]建立了HPLC 法测定发酵面制品中山梨酸含量的方法，试验成功优化了提取方法、方法适用等方面的内容。李岳等人[18]通过HPLC 法测定小儿咳喘灵口服液中山梨酸钾的含量试验，结果表明，山梨酸钾浓度在一定范围内与峰面积具有良好的线性关系（R=0.999 9），平均回收率可达到100.0%，RSD 为0.47%（n=9），线性浓度范围内与峰面积关系良好。截止到目前，研究者采用HPLC 对食品中山梨酸钾检测的研究，主要集中在检测药品[19-20]、面制品[21-22]、调味品[23-24]、果汁[25]、部分酒类[26-27]。首次提出利用HPLC 法建立慕萨莱思中山梨酸钾的测定方法，该方法建立优化成功后不仅对慕萨莱思中山梨酸钾检测方法有一定指导意义，有利于填补慕萨莱思检测方面的空白，为其产品规范化奠定一定试验基础，也对其中其他物质含量检测具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验原料与仪器

慕萨莱思样品，新疆阿瓦提县慕萨莱思生产企业提供；山梨酸标准品（≥99.99%），阿拉丁试剂（上海）有限公司提供；氨水、乙酸铵、氢氧化钠、甲醇等均为分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司提供；甲醇为色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司提供。

LC-20A 型液相色谱仪、SPD-M20A 型检测器，日本岛津公司产品；KQ- 100VDE 型双频数控超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司产品；LE203E/0 型电子天平，梅特勒- 托利多仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液制备

（1）氨水溶液。取氨水1 mL，加到99 mL 水中，混匀。

（2）乙酸铵溶液。称取乙酸铵1.54 g，加入适量水溶解，用水定容至1 000 mL，即得浓度为20 mmol/L的乙酸铵溶液，然后经0.22 μm 水相微孔滤膜过滤后备用。

1.2.2 样品处理

样品处理依据GB 5009.28—2016 中处理方法，并做一定修改。准确称取10 g 慕萨莱思，转移至容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至25 mL，过0.22 μm 针式滤膜备用。

1.2.3 标品制备

（1）山梨酸标准溶液。准确称取山梨酸钾和苯甲酸钠0.134 g 和0.118 g，用水溶解并分别定容至100 mL，得到质量浓度为1 000 mg/L 标准贮备液。使用山梨酸标准品时，需要用甲醇溶解并定容。

（2）山梨酸混合标准中间溶液。准确吸取山梨酸标准溶液各10.0 mL 于50 mL 容量瓶中，用水定容，即得质量浓度为200 mg/L 山梨酸混合标准中间溶液，于4 ℃条件下贮存。

（3）山梨酸混合标准系列工作溶液。准确吸取山梨酸混合标准中间溶液0，0.05，0.25，0.50，1.00，2.50，5.00，10.00 mL，用水定容至10 mL，配制成质量浓度分别为0，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 mg/L 的混合标准系列工作溶液，临用现配。

1.2.4 色谱条件

参照GB 5009.28—2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》第一法液相色谱法[28]，并作一定修改。色谱柱：X bridge C18（250 mm×4.6 mm，i.d.）柱（美国Waters）；流动相：A 为甲醇，B 为0.02 mol/L 乙酸铵，等度洗脱，流速0.8 mL/min；进样量10 μL，柱温30 ℃。

1.3 数据分析与处理

每个处理重复3 次，结果以X±SD 表示，采用IBM SPSS Statistics 20.0 进行方差分析，并进行Duncan's 多重比较（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

分别用X bridge C18（250 mm×4.6 mm，i.d.）柱（美国Waters）和Spursil C18（250 mm×4.6 mm，i.d.）柱（天津迪马）两款C18色谱柱分析，获得山梨酸钾标品的HPLC 色谱图。

2 种C18柱分析山梨酸的色谱峰见图1。

图1 2 种C18 柱分析山梨酸的色谱峰

由图1 可知，2 种色谱柱均能获得山梨酸的HPLC 色谱图，但是2 种色谱柱对山梨酸色谱峰的保留时间及峰形的影响较大。Spursil C18色谱柱的保留时间为21.28 min，色谱峰宽且有明显拖尾，而X bridge C18色谱柱的保留时间仅为12.85 min，且色谱峰窄，峰形尖锐，说明X bridge C18色谱柱更适合于山梨酸的HPLC 分析。

2.2 有机相比例的优化

为确认有机相对山梨酸钾标准品的影响，参照GB 5009.28—2016 中的液相色谱条件，用X bridge C18（250 mm×4.6 mm，i.d.）柱进行分析，改变A 相（甲醇）的比例，获得了山梨酸标准品和慕萨莱思的HPLC 色谱图。

山梨酸标准品在不同有机相比例下的色谱图见图2，慕萨莱思在不同有机相比例下的色谱图见图3。

图2 山梨酸标准品在不同有机相比例下的色谱图

图3 慕萨莱思在不同有机相比例下的色谱图

由图2 和图3 可知，A 相（甲醇）比例对色谱图中山梨酸的保留时间及峰形均具有较大影响。甲醇比例越大，山梨酸出峰时间越短，且峰形越尖锐，越有利于山梨酸的准确定量分析。由图3 可知，随着有机相比例的增加，慕萨莱思中山梨酸色谱峰保留时间缩短，然而当有机相比例为20%时，山梨酸色谱峰的基线不平，说明有机相比例增加，易引起色谱图基线波动，导致山梨酸色谱峰基线不稳，不利于山梨酸的准确定量。因此，慕萨莱思中山梨酸的分析应以15%的A 相（甲醇），在该条件下山梨酸的保留时间短，且基线平稳。

2.3 氨水用量对山梨酸峰面积的影响

氨水作为样品前处理中重要添加试剂，其影响因素不可小觑。首先按体积比1∶1 的比例配制氨水溶液，然后移取10 mL 慕萨莱思至容量瓶中，分别加入0，0.12，0.50，1.00，2.00，3.00 mL 氨水溶液，混匀后定容，过0.22 μm 针式滤头，然后进行HPLC分析，记录山梨酸的峰面积。

氨水用量对山梨酸钾的峰面积的影响见表1。

表1 氨水用量对山梨酸钾的峰面积的影响

尽管参照GB 5009.28—2016 的样品处理需要添加氨水调节pH 值，但由表1 可知，慕萨莱思中添加氨水，对山梨酸峰钾面积影响差异不显著（p＞0.05），说明在慕萨莱思中山梨酸含量分析时，可以不添加氨水，稀释后可以直接进行液相分析。

2.4 精密性试验

移取10 mL 慕萨莱思至25 mL 容量瓶，用蒸馏水定容，然后过0.22 μm 针式滤头，再进行HPLC分析，重复进样6 次，记录样品中山梨酸钾的峰面积，计算相对标准差（RSD）。

精密性试验见表2。

表2 精密性试验

由表2 可知，重复进样6 次后所得标准差（SD）为11 828.79，相对标准差（RSD）为1.12%，该方法测量山梨酸钾精密度良好，试验结果准确，可信度高。

2.5 稳定性试验

准备相同的慕萨莱思6 份，分别移取10 mL 慕萨莱思至25 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容，然后过0.22 μm 针式滤头备用，分别在室温条件下放置0，12，24，48，72，96 h 再进行HPLC 分析，记录样品中山梨酸钾的峰面积，计算相对标准差（RSD）。

稳定性试验见表3。

表3 稳定性试验

由表3 可知，相对标准差（RSD）为2.23%，放置时间对慕萨莱思样品中山梨酸钾含量影响很小，排除掉放置时间对慕萨莱思中山梨酸钾含量的影响。

2.6 回收率试验

首先称取100 mg 山梨酸钾标准品，用甲醇溶解定容至100 mL，获得质量浓度为1 mg/mL 山梨酸标准溶液，准确移取10 mL 的慕萨莱思样品至25 mL容量瓶中，添加一定体积山梨酸钾标准溶液，混匀后用蒸馏水定容，然后过0.22 μm 针式滤头，再进行HPLC 分析，根据峰面积计算样品中山梨酸的含量。

山梨酸的回收率见表4。

表4 山梨酸的回收率

由表4 可知，其加标回收率高达94.11%，表明其测定慕萨莱思中山梨酸钾方法准确度较高，试验可信度良好。

2.7 山梨酸的液相色谱图

对上述慕萨莱思样品及山梨酸标品进行高效液相色谱分析，得其色谱图。

山梨酸钾标准品和慕萨莱思的HPLC 色谱图见图4，山梨酸钾标准品的最大吸收波长见图5。

图4 山梨酸钾标准品和慕萨莱思的HPLC 色谱图

图5 山梨酸钾标准品的最大吸收波长

由图4 可知，山梨酸钾的保留时间为8.37 min。在200～400 nm 范围内；由图5 可知，山梨酸钾的最大吸收波长为252 nm。

2.8 山梨酸钾的标准曲线

称取一定量山梨酸钾标准物质，甲醇溶解定容，配制质量浓度约为1 mg/mL 的标准母液，用山梨酸钾标准母液，配制系列质量浓度为0.78～50.00 μg/mL 的标准工作液，按照优化后的HPLC 色谱条件分析，测定其峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度（μg/mL）为横坐标，绘制山梨酸钾标准曲线。上述慕萨莱思样品及山梨酸标品进行高效液相色谱分析，得其色谱图。

山梨酸标准品标准曲线见图6。

图6 山梨酸标准品标准曲线

由图6 得到线性回归方程为Y=80 171X+45 678，R2=0.999 9。按照Araujo P 等人[29]的方法计算，即检测限（LOD）为3×SD/m 和定量限（LOQ）为10×SD/m，其中SD 为标准曲线的截距，m 为标准曲线斜率。该方法的检测限（LOD）和定量限（QOD）分别为1.71 μg/mL 和5.70 μg/mL。这说明建立的方法适合慕萨莱思中山梨酸钾质量浓度的测定。

2.9 慕萨莱思样品中山梨酸钾的测定

移取10 mL 慕萨莱思至25 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容，然后过0.22 μm 针式滤头，再进行HPLC分析，用山梨酸钾峰面积计算样品中山梨酸钾质量浓度。

慕萨莱思样品中山梨酸钾质量浓度见图7。

图7 慕萨莱思样品中山梨酸钾质量浓度

由图7 可知，所检测慕萨莱思样品中山梨酸钾质量浓度差异很大，据GB 2760—2014—19《安全国家标准食品添加剂使用标准》规定，葡萄酒中山梨酸钾最大使用量为200 mg/kg，而明显看出D1 略微超此标准。经过后期对超标样品糖度及酒精度检测，发现超标样品均为浓缩果汁或葡萄汁原糖浆，为商家发酵前原料，商家为延长其保存时间加入过量的山梨酸钾，使得其保存时间增加，且高糖度利于后期发酵，减少经济损失，在发酵期间会进行山梨酸钾浓度降低处理，达到符合其成品慕萨莱思酒的标准范围，因此前期样品中山梨酸钾量会有所偏高。综上所述，样品中山梨酸含量差异较大，在生产和贮藏慕萨莱思过程中要精准控制山梨酸钾的质量浓度。