基于ACOX1-CPT2基因表达变化探讨肉苁蓉苯乙醇苷对高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠肝组织脂质代谢的改善作用

贾修滨,刘春燕,3,刘运超,刘伯言,张 颖

(1山东第一医科大学药学院·山东 泰安 271000;2山东第一医科大学第二附属医院·山东 泰安 271000;3泰安市中医二院·山东 泰安 271000)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是全球最广泛的肝病之一,在普通人群中患病率接近30%,中国脂肪性肝病正以每年0.594%的速度增长[1]。NAFLD的发生与发展与机体摄入热量超标紧密相关,高脂饮食导致脂肪在肝脏中过度积累诱发NAFLD[2],而其发病的初始步骤是三酰甘油(TG)在肝细胞中的沉积[3]。迄今为止,尚无针对NAFLD发病机制的特效治疗药物。寻找安全有效、机制明确的药物用于 NAFLD 的防治,成为研究者的重要任务。肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)是管状花目列当科(Orobanchaceae)肉苁蓉属的一种寄生植物,其主要成分苯乙醇苷(Phenylethanoid glycosides)具有增强机体免疫功能、抗衰老、抗辐射、抗氧化以及保肝等作用[4-5]。本研究拟对肉苁蓉苯乙醇苷(Phenyle-thanoid glycosides fromCistanchedeserticola, PGCD)改善脂质代谢的作用机制进行初步探讨。

1 实验材料

1.1 实验药物 肉苁蓉肉质茎(含水量8.5%)购买于安徽亳州康美中药城;苯乙醇苷(主要成分毛蕊花糖苷和松果菊苷)对照品(纯度均为>98%)购买于四川成都曼斯特生物科技有限公司;阿伐他汀：上海辉瑞公司;依折麦布：默沙东制药有限公司。

1.2 实验动物 6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠,体质量(20±2)g,购买于常州卡文斯实验动物有限公司,许可证号：SCXK(苏)2016-0010,12 h/12 h循环光照,温度(22±1)℃,湿度50%～60%,自由摄入食物和水。实验前,小鼠喂饲标准饲料适应1 周。所有动物养护和实验均遵循山东第一医科大学实验动物伦理委员会章程(伦理学编号：W202107080303)。

1.3 实验试剂 高脂饲料：Harlan Teklad;TG、ALT、AST试剂盒：北京索莱宝生物科技有限公司;FAS、LCAD试剂盒：上海朗顿生物科技有限公司;GSH-Px 试剂盒：上海纪宁生物科技有限公司;SOD、MDA、LPO、BCA试剂盒：南京建成生物科技有限公司;Trizol 试剂盒：Invitrogen, Carlsbad, CA;ACOX1和 CPT2引物：生工生物工程(上海)有限公司设计。

1.4 实验仪器 Hei-VAP Expert 旋转蒸发仪：德国Heidolph;Varioskan LUX多功能酶标仪：Thermo Fisher;FD8508真空冷冻干燥机：韩国Ilshin;F6/10匀浆器：上海氟鲁克;Agilent1260高效液相色谱仪、Cary 3500紫外分光光度计：安捷伦科技有限公司;Quant Studio5RT-PCR仪：赛默飞世尔生物化学制品有限公司。

2 实验方法

2.1 药物提取及含量测定 参照以往方法提取纯化肉苁蓉苯乙醇苷[4]：称取适量干燥后的肉苁蓉肉质茎粉末(40目),65 ℃条件下50%乙醇超声提取46 min,3 次,浓缩滤液,浓缩液经水稀释,采用HPD300大孔吸附树脂纯化得到苯乙醇苷提取物。紫外分光光度法333 nm处检测总苯乙醇苷含量,高效液相色谱法检测苯乙醇苷主要活性成分毛蕊花糖苷和松果菊苷的含量。

2.2 动物分组及给药 70 只雄性ApoE-/-小鼠随机分为模型组(MOD)、阿伐他汀[20 mg/(kg·d)]+依折麦布[20 mg/(kg·d)]阳性对照组(A+C)及肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组[250、500、1 000 mg/(kg·d)](L-PGCD、M-PGCD、H-PGCD),每组14 只,均以高脂饲料(脂肪42%,胆固醇0.15%)喂饲12 周;另取14 只雄性C57BL/6J小鼠喂食普通饲料作为正常对照组(CON)。

2.3 观察指标及测定 12 周末,小鼠禁食过夜,实验前称量体质量,戊巴比妥钠麻醉后处死小鼠,血浆在4 ℃条件下离心,离心半径7.5 cm,3 000 r/min,15 min,取血清低温保存;取肝组织称重,于-80℃保存。

2.3.1 体质量和肝脏指数 12周末,小鼠禁食后称量体质量,戊巴比妥钠麻醉后处死小鼠,取肝脏,计算肝脏指数。

2.3.2 血清指标检测 取血清,按照试剂盒操作依次检测血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性;BCA测定血清中蛋白含量,检测TG含量。

2.3.3 肝组织脂质代谢相关因子检测 4 ℃条件下,称取适量新鲜肝脏于PBS中匀浆,离心(离心半径7.5 cm,3 000 r/min)匀浆液1 min,取上清液,BCA测定肝组织蛋白含量,检测肝组织中TG含量,ELISA方法检测肝组织脂肪酸合成酶(FAS)和长链酰基辅酶A脱氢酶(LCAD)含量。

2.3.4 肝组织相关氧化因子检测 4 ℃条件下,称取适量新鲜肝脏于PBS中匀浆,离心(离心半径7.5 cm,3 000 r/min)匀浆液15 min,取上清液,BCA测定肝组织蛋白含量,按照试剂盒说明检测超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,同时检测丙二醛(MDA)和脂质过氧化物(LPO)含量。

2.3.5 RT-PCR检测肝组织ACOX1/CPT2 mRNA表达 取新鲜肝脏组织适量,采用Trizol 试剂盒提取肝组织总mRNA,利用MuLV逆转录酶进行cDNA合成,以 cDNA 为模板,进行实时荧光定量 PCR(quantitative realtime PCR,Qpcr)检测, 反应条件为95 ℃预变性2 min;95 ℃变性10 s、退火： 60 ℃ 30 s、72 ℃延伸 35 s,循环次数 34 次,最后 72 ℃条件下再延伸 5 min,自动分析仪实时定量ACOX1和CPT2 mRNA表达。采用Rotor-gene Q software ver.1.7 (Qiagen) 进行数据分析,2-△△Ct方法统计mRNA相对GAPDH水平,每组实验平行进行>3 次。引物序列如下： GAPDH, 上游： 5’-TGCCACCC AGAAGACTGTG-3’, 下游： 5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’; ACOX1,上游： 5’-CGCCACCTT CAATCC AGAGT-3’ 下游： 5’-TCTGCGATGCCAAATTCCCT-3’; CPT2, 上游： 5’-TCCTCCTACTC AGGACGCAA-3’ 下游：TTGGGATCTTCCGCTCACAC。

3 实验结果

3.1 肉苁蓉提取物中苯乙醇苷含量及其主要活性成分 紫外分光光度计检测纯化后的提取物中苯乙醇苷含量为81.00%,高效液相色谱检测苯乙醇苷中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量分别为31.16%和7.23%。

3.2 肉苁蓉苯乙醇苷对小鼠体质量及肝脏指数的影响 见表1。

表1 各组小鼠体质量、肝脏指数比较

3.3 肉苁蓉苯乙醇苷对小鼠血清TG、ALT、AST水平的影响 见表2。

表2 各组小鼠血清TG、ALT、AST水平比较

3.4 肉苁蓉苯乙醇苷对小鼠肝脏脂质及脂质代谢酶含量的影响 见表3。

表3 各组小鼠肝组织TG含量及FAS、LCAD含量比较

3.5 肉苁蓉苯乙醇苷对小鼠肝组织相关氧化因子的影响 见表4。

表4 各组小鼠肝组织GSH-PX、SOD活性及MDA、LPO含量比较

3.6 肉苁蓉苯乙醇苷对ACOX1/CPT2 mRNA表达的影响 见图1。

注：与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01图1 各组小鼠肝组织ACOX1、CPT2 mRNA表达的RT-PCR检测结果比较

4 讨论

肝脏是机体最主要的代谢器官,肝脂质代谢障碍可引发多种疾病,例如NAFLD、高脂血症、代谢综合征、动脉粥样硬化等。肝脏内脂质代谢包括脂肪合成和脂肪分解,二者相互作用以维持脂代谢的平衡。FAS是哺乳动物细胞内源性脂肪酸合成过程的重要酶系之一,也是脂肪酸合成的关键酶,可催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成TG,FAS主要调控脂肪酸的合成[6]。正常肝细胞中FAS呈低表达,而代谢异常组织中的FAS呈过表达,在许多代谢相关疾病的发展过程中起重要作用。本文结果可见,肉苁蓉苯乙醇苷可显著降低肝组织FAS水平,提示其在抑制肝细胞脂质合成中发挥一定作用。LCAD在肝细胞脂肪酸β氧化中催化长链脂肪酸第一步脱氢反应,是脂肪酸分解代谢的关键酶[7]。本文结果可见,肉苁蓉苯乙醇苷可显著上调LCAD含量,提示其具有加速肝脏脂质代谢之功效。

ACOX1作为β氧化酶之一,在脂肪酸进入线粒体后,发挥重要作用。ACOX1是脂肪酸β氧化的关键限速酶,主要调节脂肪酸在线粒体和过氧化物酶体中的β氧化过程,促进脂肪酸的代谢[8]。ACOX1 还是过氧化体氧化增殖的标志,研究显示ACOX1基因敲除小鼠,肝细胞严重脂肪变性和自发过氧化体增殖,证实了ACOX1 在 NAFLD 中的作用[9-10]。本文实验结果表明,高脂饮食导致脂肪酸代谢过程显著减慢,肝内脂质沉积和过氧化物MDA、LPO增多;肉苁蓉苯乙醇苷可剂量依赖性地升高ACOX1 mRNA在肝组织的表达水平,抑制FAS的活性,从而显著降低TG 在肝组织的沉积和MDA、LPO过度表达。

CPT系统不仅在长链脂肪酸β-氧化这一过程中起着重要作用,同时 CPT 系统也是线粒体脂肪酸氧化产生ATP 的关键组成部分[11]。CPT2基因是CPT家族中的一个亚型,CPT2 蛋白位于线粒体内膜,是线粒体β-氧化的限速酶。在脂代谢过程中,CPT2 基因参与TG分解与脂肪酸代谢相关酶基因的转录活化,从而调控相关酶的表达,对脂代谢起调控作用[12]。本实验结果显示,高、中剂量肉苁蓉苯乙醇苷可显著提升CPT2 mRNA在肝组织的表达水平,表明肉苁蓉苯乙醇苷能改善脂肪酸β氧化障碍,减少异常代谢产物堆积,逆转脂质氧化增加趋势,从而降低脂质在肝组织的沉积。

肉苁蓉因富含苯乙醇苷类、糖类、环炼醚蔽类、挥发油类、木脂素类、生物碱类、氨基酸等多种活性成分而被誉为“沙漠人参”,不仅作为传统名贵中药材,也是常用的补益用品之一[13]。苯乙醇苷类物质是肉苁蓉的主要活性成分,其种类和含量是评价肉苁蓉质量的重要指标[14]。本研究初步探讨了肉苁蓉苯乙醇苷对肝组织脂质代谢的影响,结果表明肉苁蓉苯乙醇苷能够显著降低高脂饮食诱导的小鼠血清和肝组织中TG含量升高,与其调控脂质代谢的FAS酶和LCAD酶含量有关。实验显示肉苁蓉苯乙醇苷可提高抗氧化酶SOD和GSH-px酶活性,降低脂质过氧化物MDA和LPO含量,抑制高脂饮食诱导的肝组织ALT和AST活性,从而改善高脂饮食诱导的肝组织过氧化损伤。关于肉苁蓉苯乙醇苷各活性成分的药理作用及其其调控ACOX1/CPT2的深入机制将在后续研究中报道。