辣木籽粕多肽亚铁螯合物的制备及其结构分析

2024-01-13李美萍郭彩霞尉立刚

中国粮油学报 2023年11期

侯健, 李美萍, 郭彩霞, 尉立刚

(山西大学生命科学学院,太原 030006)

生物活性肽是由2个及以上的氨基酸残基组成的一类对生命有机体具有重要生理功能的功能分子,不同的来源、氨基酸组成和排列方式决定了不同的活性肽可能具有抗炎、抗菌、抗氧化、促进酒精代谢、降血压、免疫调节等一种或多种生理功能[1,2],对于人体生理机能具有潜在的调节作用[3]。铁是人体必须微量营养元素[4],是细胞色素、血红蛋白、铁蛋白、肌红蛋白以及各种酶的重要组成部分,而且也参与体内的氧转运和储存、电子转移反应、基因调节以及细胞生长和分化调节等重要过程[5]。人体内铁的缺失会影响细胞代谢和机体生理生化等过程,从而导致机体的免疫功能受损[6]、肠道菌群紊乱[7]等一系列问题,对人体的营养与健康产生负面影响。

目前广泛使用的铁离子营养补充剂主要为无机铁盐类和小分子有机铁盐类[8],但各种金属盐类有可能会影响食品的物理和感官特性,同时还存在吸收率低,对肠道有刺激、稳定性差等缺点[9]。以蛋白多肽为载体,螯合亚铁离子制得的生物性铁补充剂,对比金属盐类补充剂不仅提高了亚铁离子的稳定性、吸收率、安全性和生物利用度[10],同时金属离子与多肽螯合之后也可能会增强多肽原本的生物活性,或者使多肽获得一些本身不具备的生物活性[11],是一种潜在的金属盐类替代品。已有研究利用鸭蛋清[12]、鱼鳞[13]、豌豆[14]、小米麸皮[15]等不同动物与植物性来源蛋白获得亚铁离子螯合肽。辣木籽是一种新兴的药食同源物,其提取油脂之后的加工副产物—辣木籽粕中蛋白质量分数占到50%以上,是良好的蛋白资源[16]。

目前对辣木籽粕多肽与亚铁离子螯合的研究鲜有报道。本研究以辣木籽粕多肽为配体,以Fe2+为金属螯合离子,制备辣木籽粕多肽-亚铁螯合物,利用单因素和响应面实验优化螯合物的制备工艺;通过光谱法分析螯合物的结构,并对其氨基酸组成进行分析,同时利用扫描电镜观察辣木籽粕多肽及其螯合物的微观样貌,以期开发辣木籽粕多肽-亚铁营养补充剂,为提高辣木籽资源附加价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣木籽粕酶解多肽液(实验室自制)、氯化亚铁、邻菲罗啉、盐酸羟胺、抗坏血酸、1-苯胺基-8-萘基磺酸盐(ANS)、乙酸钠、乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

pH-220W型pH计,SC-3614低速离心机,UV-2550紫外-可见光谱仪,Nicolet380傅里叶变换红外光谱仪,LS-55荧光分光光度计,Artemis6000C全自动氨基酸分析仪, JSM-IT500HR扫描电子显微镜。

1.3 实验方法

1.3.1 辣木籽粕多肽-亚铁螯合物制备

参考文献[17]并做一定修改。取一定浓度的辣木籽粕酶解多肽液,调节多肽液pH值,按照一定比例加入氯化亚铁与抗坏血酸振荡混匀,反应一定时间后离心(3 622 g×15 min)收集上清液,加入5倍体积的乙醇静置沉淀3 h,离心(3 622 g×15 min)收集沉淀,冻干得到辣木籽粕多肽-亚铁螯合物。

1.3.2 单因素实验

辣木籽粕多肽与亚铁离子进行螯合,以pH=5、多肽质量浓度8.8 mg/mL、肽铁质量比为4∶1、螯合温度40 ℃、螯合时间20 min为基础条件,亚铁螯合率为考察指标,探究螯合pH值(3、4、5、6、7)、肽铁质量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)、多肽浓度(1.1、2.2、4.4、6.6、8.8、10.0 mg/mL)、螯合温度(25、40、50、60、70 ℃)、螯合时间(5、10、20、30、40、50、60 min)各因素对螯合率的影响。

1.3.3 响应面优化实验

在单因素实验基础上,固定螯合时间20 min、螯合温度40 ℃,选取肽铁质量比、多肽浓度、pH值为考察因素(分别以A、B、C 表示),以亚铁螯合率为响应值设计3因素3水平响应面分析实验,其因素水平见表1。

表1 响应面因素和水平

1.3.4 亚铁离子螯合率的测定

铁含量测定采用邻菲罗啉[18]比色法:以氯化亚铁质量浓度x(mg/mL)为横坐标,以吸光度y为纵坐标绘制标准曲线,得到标准曲线方程为y=8.080 5x+0.013 7,R2=0.999。

然后对样品进行测定,带入标曲计算样品中氯化亚铁的量。

式中:c为稀释样品中氯化亚铁的质量/mg;n为样品测定时的稀释倍数;m为添加的氯化亚铁的总质量/mg。

1.3.5 紫外光谱分析

分别取一定量的辣木籽粕多肽、多肽-亚铁螯合物、氯化亚铁和抗坏血酸用水溶解,在紫外-可见光谱仪200～450 nm全波段扫描。

1.3.6 红外光谱分析

称取适量样品和溴化钾于玛瑙研钵中研磨混匀[样品和溴化钾质量比在1∶(100～150)],之后置于压片机内50 MPa保持1 min压制成片,在4 000～400 cm-1,分辨率为4 cm-1条件下,扫描32次,获得红外光谱图。

1.3.7 表面疏水性指数S的测定

依据Liu等[19]的方法略作修改。用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH 7.0)将辣木籽粕多肽液进行稀释,使其梯度质量浓度为 0.022、0.055、0.110、0.220、0.330、0.440 mg/mL;同时用磷酸盐缓冲液配制不同质量浓度的多肽-亚铁螯合物溶液(0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL)。将不同浓度的样品(4 mL)与20 μL的ANS荧光探针(8 mmol/L,用pH=7.0,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液配制)涡旋混匀,避光静置15 min。在激发波长、发射波长分别为390 nm和500 nm,狭缝宽度为5 nm条件下测定样品的荧光强度。以样品浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标拟合曲线,直线斜率即为样品的表面疏水性指数S。

1.3.8 荧光光谱分析

根据Xi等[20]研究方法测定样品荧光光谱。将辣木籽粕多肽液、多肽-亚铁螯合物等样品用水溶解稀释,获得不同浓度的样品溶液。固定激发波长为285 nm,狭缝宽度为5 nm,扫描样品在300～550 nm 范围内的荧光发射光谱。

1.3.9 多肽-亚铁螯合物的氨基酸组成分析

参照国标GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》的方法进行测定。

1.3.10 扫描电镜及能谱分析

采用扫描电子显微镜(SEM)联用X射线能谱仪(EDS)观察辣木籽粕多肽与多肽-亚铁螯合物的表面微观形貌,分析螯合前后样品表面的元素组成。

1.3.11 数据处理

使用Design-Expert V8.0.6和Origin 2019b对数据进行处理分析与作图。

2 结果与讨论

2.1 辣木籽粕多肽-亚铁螯合物制备单因素实验

由图1可知,辣木籽粕酶解多肽与亚铁离子的螯合率随pH的增加先上升后下降。在pH值较低时反应体系中含有大量的H+,而H+会与供电子基团反应形成氧化物沉淀,与亚铁离子之间产生竞争关系,导致螯合率较低;随着pH值的上升,反应体系中H+浓度逐渐减小、OH-浓度逐渐增大,OH-也会与供电子基团产生竞争关系,争抢亚铁离子反应生成氢氧化物沉淀,从而使螯合率降低[21],故选择最适pH=5。在肽铁质量比从1∶1～4∶1逐渐增加时,辣木籽粕酶解多肽与亚铁离子螯合率也逐渐上升,而当肽铁质量比大于4∶1时,亚铁螯合率又开始缓慢下降。辣木籽粕多肽结合亚铁离子的量是一定的,在质量比较小时亚铁离子较多,多肽没有足够的活性位点与之结合,造成亚铁离子的浪费;而在质量比较大时,亚铁离子的含量较低,螯合物的结构不稳定,对螯合率也有一定的影响[22],所以选择最适肽铁质量比为4∶1。

图1 各因素对辣木籽粕多肽-亚铁物螯合率的影响

在多肽质量浓度从2.2～8.8 mg/mL逐渐增加时,辣木籽粕酶解多肽与亚铁离子螯合率也逐渐上升,而当多肽质量浓度大于8.8 mg/mL后,亚铁螯合率又开始缓慢下降。这可能是由于多肽在低浓度条件下体系的流动性比较好,多肽与亚铁离子不易形成稳定的络合物,而高浓度多肽液体系流动性又会减弱,使多肽与亚铁离子不能够充分接触,从而导致螯合能力下降[23],故选择最适多肽浓度为8.8 mg/mL。随着温度和时间的变化,螯合率虽然也呈现先上升后下降的变化,但是变化趋势平缓,对于螯合率的影响较小,故确定螯合温度为40 ℃,螯合时间为20 min。

2.2 响应面实验优化多肽-亚铁螯合物制备工艺

2.2.1 响应面实验设计及结果

在单因素实验基础上,固定螯合温度为40 ℃,螯合时间为20 min,选取肽铁质量比、多肽浓度、pH值为考察因素(分别以A、B、C 表示),以螯合率为响应值设计三因素三水平响应面分析实验。响应面实验设计及结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果

利用Design-Expert对表2中的实验数据进行回归拟合,得到各因素与螯合率的二次多项回归模型方程:Y=88.21+3.19A-1.94B-3.25C+2.82AB+1.16AC+0.93BC-8.9A2-4.640B2-5.55C2。

2.2.2 响应面模型建立与显著性分析

对亚铁螯合率的二次多项回归模型进行方差分析和显著性检验,结果如表3所示。

表3 回归方程方差分析

对亚铁离子螯合率的回归模型系数进行显著性检验,可知模型的一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2以及AB影响极显著;通过对回归系数的比较可知,各因素对辣木籽粕多肽与亚铁离子螯合率的影响次序为:C(pH)>A(肽铁质量比)>B(多肽质量浓度)。

2.2.3 最佳参数的确定及模型验证

通过Design-Expert软件的预测分析功能,优化得到辣木籽粕多肽与亚铁离子螯合的最佳条件为:肽铁质量比4.13∶1,多肽质量浓度7.92 mg/mL,pH=4.70,在此条件下多肽提取率预测值为89.09%。结合实际操作情况,调整螯合工艺为:肽铁质量比4.1∶1,多肽质量浓度7.90 mg/mL,pH=4.70。在调整后的条件下进行3次平行实验,辣木籽粕多肽与亚铁离子的螯合率为(88.27±1.49)%,这与模型的预测值很接近,证明了二次多项回归模型方程的可靠性。

2.3 多肽-亚铁螯合物的紫外光谱分析

如图2所示,氯化亚铁在200～450 nm区间内没有明显的吸收峰;辣木籽粕多肽在267 nm附近有1个特征吸收峰,VC的特征吸收峰最大吸收波长在264 nm处;辣木籽粕多肽与VC混合之后在267 nm处与辣木籽粕多肽相同的吸收峰,且其吸光度值与辣木籽粕多肽+VC的吸光度值接近,表明在反应体系中加入VC对于辣木籽粕多肽的结构没有太大的影响;而辣木籽粕多肽-亚铁螯合物在267 nm附近的吸收峰消失,且相对于辣木籽粕多肽吸收峰值有所增强,由此可以推断有新的物质生成[24]。Athira等[25]将乳清蛋白衍生肽与亚铁离子螯合之后的紫外光谱图也表现出类似的变化。

图2 酶解多肽与螯合物紫外吸收光谱

2.4 多肽-亚铁螯合物的荧光光谱分析

2.4.1 表面疏水性

图3通过对荧光强度和样品浓度做曲线得出:多肽的表面疏水指数S0=1 445,螯合物的表面疏水指数S1=708,螯合物相对于多肽的表面疏水性显著下降。可能是与非极性氨基酸相比,极性氨基酸更易于与亚铁离子结合[26],从而螯合物中极性氨基酸可能较多,非极性氨基酸较少;而非极性氨基酸所占比例越低,样品表现出来的表面疏水性越低[27],从而螯合物的表面疏水性相对于多肽会显著下降。

图3 酶解多肽与螯合物的表面疏水性

2.4.2 荧光光谱图

如图4所示,酶解多肽在367 nm附近出现最大发射峰;FeCl2和VC在367 nm处没有显示荧光强度,不会对螯合物的荧光强度产生影响。与酶解多肽相比,螯合物的最大发射波长产生轻微的红移(从367 nm移动到371 nm),且荧光强度明显减弱。最大发射波长移动与荧光强度降低是多肽结构发生折叠变化的典型标志[28],可能是多肽与亚铁离子螯合, 导致多肽中色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸的构象发生了变化,使其固有荧光发生猝灭作用,荧光强度下降[29]。结果表明多肽与亚铁离子螯合之后产生了一种新的物质。

图4 酶解多肽与螯合物荧光光谱

2.5 多肽-亚铁螯合物的红外光谱分析

图5 酶解多肽及其螯合物的红外光谱

2.6 多肽-亚铁螯合物扫描电镜及能谱分析

辣木籽粕酶解多肽与螯合物的电子扫描显微镜图如图6所示,多肽的微观结构相对松散,表面光滑且呈不规则片状;而螯合物微观结构更加紧密,表面主体颗粒状呈交织结构;Wang等[32]制备的南极磷虾肽-铁复合物也有类似的形态。多肽与螯合物在表观形态发生了明显变化,说明亚铁离子与辣木籽粕多肽中的基团结合产生了新物质。同时对多肽和螯合物进行能谱分析(EDS),结果如表4所示。

图6 多肽及螯合物的扫描电镜图

表4 多肽与螯合物中各元素质量分数/%

由表4可知,多肽中的主要元素为C、O、S等,这些元素质量分数占到了90%以上;而螯合物中主要元素除了C、O、S外,还含有质量分数11.15%左右的铁元素,表明亚铁离子与多肽之间的确通过螯合作用成功结合在一起。

2.7 多肽-亚铁螯合物的氨基酸组成分析

辣木籽粕多肽在螯合前后的氨基酸组成及含量如表5所示。辣木籽粕多肽及其螯合物的氨基酸有16种,辣木籽粕多肽中Glu、Arg、Leu、Gly含量相对较高,此外还有Asp、His、Lys、Ala、Val、等氨基酸,Cys质量分数最低(<0.01%);已有研究证实His、Glu、Asp、Lys、Cys等氨基酸的残基侧链均可提供与亚铁离子结合的配体,会在与金属螯合反应中起到关键作用[33,34]。与辣木籽粕多肽相比,螯合物中氨基酸组成有所改变,其中Cys与Arg的质量分数分别增加了2.66%与4.17%,His、Lys、Glu等极性氨基酸也有不同程度的增加,表明这几种氨基酸都参与了亚铁的螯合。而螯合物中Ala、Val、Leu、Phe等疏水性氨基酸总质量分数从29.09%下降至20.38%,可能相比于疏水性氨基酸,亲水性氨基酸的存在更有助于多肽与亚铁的螯合[35],这与表面疏水性分析结果相吻合。