高效裂解性宽谱大肠杆菌噬菌体筛选方法探究

屈平平，杨明彩，温华梅，李涛

（山东畜牧兽医职业学院 山东潍坊 261061）

近年来，随着畜牧业“禁抗减抗”执行力度的加大和国家对食品安全的重视，噬菌体，作为细菌的天然杀手，具有特异性强、繁殖速度快、不易产生耐药性、对真核细胞无毒副作用等优势[1-2]，噬菌体及裂解酶在疾病治疗、环境消毒、食品保存等方面的应用越来越广泛[3-5]。如何从自然界筛选到效价高、暴发量大、裂解谱广、抗逆性强的裂解性噬菌体，是噬菌体及其裂解酶研究和开发利用的根本。本试验以免致病性大肠杆菌为宿主菌，研究了高效裂解性宽谱大肠杆菌噬菌体的筛选方法，为下一步大肠杆菌噬菌体的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）污水：取自山东地区（青岛、潍坊、临沂、莱芜）肉兔养殖较为密集的养殖场周边污水。

表1 污水采集地区及标号

2）指示菌：用于筛选噬菌体的宿主菌为本实验室保存的11株兔肠源致病性大肠杆菌。

3）主要试剂与仪器：麦康凯培养基、营养琼脂液体培养基、营养琼脂固体培养基等，均购自北京路桥技术有限公司；甘油，购自烟台远东精细化工有限公司；SM 缓冲液，购自北京雷根生物有限公司。主要仪器由一次性注射器，一次性0.22 μm 微孔针式过滤器，超净工作台、水浴锅、透射电子显微镜（HT7700 型，HITACHI）。

1.2 培养基制备

1）麦康凯培养基：取10 g，加入200 mL 蒸馏水，121 ℃高压15 min，冷却至50 ℃，倒板备用。

2）LB 液体培养基：分别称取胰蛋白胨10 g、酵母浸膏粉5 g 和NaCl 10 g，加入蒸馏水1 L，加热并不断搅拌至其溶解，121 ℃高压灭菌15 min，4 ℃保存备用。

3）LB 固体培养基：分别称取胰蛋白胨10 g、酵母浸膏粉5 g、NaCl 10 g 和琼脂粉15 g，加入蒸馏水1 L，加热并不断搅拌至其溶解，121 ℃高压灭菌15 min，室温冷却至50 ℃左右，倒入高压灭菌的平皿中，冷却凝固，4 ℃保存备用。

4）LB 半固体培养基：称量5 g LB 肉汤，1.4 g 琼脂粉，加入含有200 mL 蒸馏水的锥形瓶中，搅拌均匀，煮沸至完全溶解，对其进行灭菌处理，灭菌完成后保存备用。

2 试验方法

2.1 宿主菌菌液的制备

取-80 ℃保存的11株兔源大肠杆菌（编号为tE1-tE11）在麦康凯培养基上划线纯化，放置于37 ℃恒温培养箱，培养24 h，挑取纯化后的单菌落于LB 液体培养基中，37 ℃恒温摇床培养8 h 至对数期，得到大肠杆菌菌悬液。

2.2 可疑噬菌体的初选

分别取10mL 污水（编号为1#-12#）于带盖塑料离心管中，12 000 r/min 离心10 min 去除大部分固体杂质，上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌。取0.1 mL 污水过滤液加入10 mL 已灭菌LB 液体培养基中，再加入0.1 mL 宿主菌菌液，37 ℃、180 r/min 振荡培养过夜，次日将5 mL 培养液8 000 r/min 离心15 min，上清液经过经0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，将过滤液保存与无菌青霉素，室温保存备用。

利用滴定法检测污水中有无噬菌体存在，取100 μL 大肠杆菌菌悬液涂布于LB 固体培养基平板上，在平板背面画出分割线并进行标号，根据平板标号点滴样品滤液，每个标号方格中滴加10 μL，37 ℃恒温培养箱过夜培养，观察有无空斑出现。空斑大而透亮者，说明该污水中可能含有裂解性比较强的噬菌体（如图1 中4#、6#和7#污水中可能存在能高效裂解宿主菌tE1 的噬菌体）。空斑小，浑浊，内有少量细菌者，说明该污水中虽然存在能裂解该细菌的噬菌体，但裂解不彻底，裂解能力较差（如图1 中8#和9#污水中存在的噬菌体裂解宿主菌tE1 能力相对差）。优选空斑大而透亮者，再进一步进行噬菌体的分离和纯化。

图1 滴定法检测污水中有无噬菌体的演示

2.3 宽谱噬菌体的筛选

将大而透亮的空斑用无菌眼科手术镊抠出，加入10 mL LB 液体培养基，再加入100 μL 宿主菌菌悬液，37 ℃180 r/min 振荡培养过夜，次日将噬菌体增殖液过0.22 μm 滤膜，得到噬菌体过滤液。然后进行交叉滴定试验，即利用一种噬菌体过滤液滴定其他噬菌体的宿主菌，看有无空斑出现，出现空斑较多者，说明该噬菌体的裂解谱较宽，有可能为宽谱噬菌体。

2.4 噬菌体的分离与纯化

将疑似宽谱噬菌体的过滤液进行梯度稀释，取合适梯度噬菌体稀释液0.1 mL 与0.2 mL 宿主菌菌液混合，加入4mL 约55 ℃LB半固体培养基，混匀后倒入LB 平板上，平板凝固后倒置于37 ℃培养箱4～6 h，观察噬菌斑大小、形状及透明度，并记录噬菌体效价。将有透亮噬菌斑，且效价较高的样品，利用双层平板法进一步纯化，重复3～5 次后，最终得到噬菌斑透而亮，形状和大小一致。

2.5 噬菌体的分类与命名

将筛选的宽谱噬菌体，用磷钨酸负染法进行透射电镜观察。取富集后的噬菌体缓冲液15 μL 滴于铜网上，静置15 min，用滤纸吸干多余液体，然后滴一滴磷钨酸（2%）染色，等待10min，干燥后通过电子显微镜观察其形态。根据《根据国际病毒分类委员会（ICTV）在2011年发布的第9 次报告中噬菌体的分类与命名标准》[6]和相关文献[7]对噬菌体进行分类和命名。

3 试验结果

3.1 噬菌体的初步筛选

通过噬菌体原液滴定宿主菌，在普通平板上空斑的情况见表2和图2，其中空斑大而透亮的有tE1-2#、tE1-5#、tE1-7#、tE1-9#、tE1-10#、tE2 -9#、tE2 -10#、tE5 -2#、tE5 -5#、tE5 -9#、tE5 -10#、tE5 -11#、tE6-2#、tE6-5#、tE6-9#、tE6-10#、tE6-11#、tE10-11#，因此，利用滴定法初步筛选到18株裂解性比较强的噬菌体。

图2 滴定试验出现空斑的情况

表2 滴定法初次筛选噬菌体的结果

3.2 宽谱噬菌体的筛选

利用一种噬菌体过滤液滴定其他噬菌体的宿主菌，出现空斑的情况见表3。可知噬菌体tE6-5#除了可以裂解宿主菌tE6，还可裂解宿主菌tE1、tE2、tE5、tE10；噬菌体tE10-11#可以裂解宿主菌tE10，还可裂解宿主菌tE1、tE2、tE5、tE6；其他噬菌体仅能裂解1 种或者2 种宿主菌。因此，噬菌体tE6-5#和噬菌体tE10-11#很可能为宽谱噬菌体。

表3 宽谱噬菌体的筛选结果

3.3 疑似宽谱噬菌体的分离和纯化结果

经过纯化后，tE6-5#的噬菌斑为圆形，直径约0.8～1 mm，边缘整齐无晕环，完全透亮（见图3），效价为5.42×108PFU/mL。tE10-11#的噬菌斑圆形，直径约2～2.5 mm，边缘整齐无晕环，完全透亮（见图4），效价为8.26×109pfu/mL。

图3 tE6-5# 噬菌斑形态

图4 tE10-11# 噬菌斑形态

3.4 噬菌体的分类与命名

通过透射电镜观察到噬菌体tE6-5#，平面观察头部大致呈长六角形，长径约为59.6 nm，横径约为57.3 nm，尾部长约106 nm，无明显的颈部（见图5），从形态和结构上可初步判定该噬菌体属于有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科，暂命名为vB-EcoM-tE6。噬菌体tE10-11#，头部呈二十面体，长径约为52.5 nm，横径约为51.6 nm，尾部长约86.9 nm，有明显的颈部（见图6），从形态和结构上可初步判定该噬菌体也属于有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科，暂命名为vB-EcoM-tE10。

图5 vB-EcoM-tE6 电镜形态

图6 vB-EcoM-tE10 电镜形态

4 讨论

近年来，众多研究者以禽源、羊源、猪源致病性大肠杆菌等为宿主菌，筛选了多株大肠杆菌噬菌体，并对其生物学特性和分子生物学信息进行了深入的研究[8-11]。旨在筛选出安全、高效、潜在利用价值高的宽谱裂解性噬菌体。由于自然界中的噬菌体种类和数量多，特异性强，理想型噬菌体的筛选成为噬菌体开发和利用的前提，也是研发工作中最为繁琐的环节。

本项目组探索了一套省时省力、高效筛选目的噬菌体的方法。首先是利用滴定法根据空斑的大小和透明度，初步筛选出裂解能力较强的噬菌体，再利用交叉滴定法，筛选出能够裂解多株宿主菌的宽谱噬菌体，最后利用双层平板法，筛选和纯化出效价高、噬菌斑大而透的噬菌体。这种方法可以避免一开始就利用双层平板法初选噬菌体和盲目对大量未知噬菌体的分离和纯化过程中时间、精力、试验材料的消耗，大大提高了科研工作的效率，在很大程度节约了试验耗材和试剂的投入。

根据电镜下噬菌体形态学特征，本试验从莱芜和青岛某兔场污水种中分离的大肠杆菌噬菌体vB-EcoM-tE6 和vB-EcoM-tE10 均为有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科。与赵剑等[12]以一株兔非典型肠致病型大肠杆菌（ZR1）为宿主菌，分离到的噬菌体ZRP1；与王志鹏等[13]以1株致病性大肠埃希菌为宿主菌，分离纯化的出4株噬菌体ZRP2、ZRP3、ZRP4 和ZRP5，在形态上具有相似性，符合大肠杆菌噬菌体的一般特征。噬菌体vB-EcoM-tE6 和vB-EcoM-tE10 的效价在109～1010之间，至少能裂解5 种以上的致病性大肠杆菌，符合高效裂解性宽谱噬菌体的特点，很可能具有很高的开发和利用价值。■