姜黄素通过EZH2/PPARγ途径抑制肝星状细胞活化

史晓燕,潘 萌

(陕西中医药大学基础医学院生物化学教研室,咸阳 712046;*通讯作者,E-mail：biosalome@163.com)

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是肝脏应对各种损伤刺激后组织修复过程中的代偿反应,其病理表现为细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)分泌增加而降解减少,引起纤维结缔组织的过度沉积,并影响肝脏的正常生理功能。肝纤维化如得不到有效治疗,将发展成为肝硬化甚至肝癌,严重危害人们的健康和生命[1]。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化是肝纤维化发生发展的核心环节,该过程伴随大量炎性因子的分泌及纤维化相关蛋白的表达,并最终转分化为肌成纤维细胞(myofibroblast cell,MFC)[2,3]。因此,深入研究HSCs活化的机制,寻找抑制HSCs活化的有效药物,对肝纤维化的防治具有重要意义。姜黄素是从姜黄中提取的一种植物多酚,具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等功能[4-6]。近年来的体内外研究证实,姜黄素对肝纤维化具有一定的防治作用,并对其机制进行了广泛探索[7,8]。Zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是一种组蛋白甲基转移酶,在表观遗传修饰中发挥重要作用,其异常激活在肝纤维化、肝癌患者中极为常见,提示其与肝纤维化的发生发展具有密切关系[9-11]。已有研究表明姜黄素对EZH2的表达有一定的抑制作用[12,13],但姜黄素是否能够通过EZH2对肝纤维化的发生起一定的抑制作用,目前尚不清楚。本研究基于EZH2对纤维化抑制因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)的调控作用,从细胞水平探讨姜黄素的抗肝纤维化机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自北纳生物公司(BNCC);姜黄素购自美国Sigma公司;DMEM细胞培养基、胰酶、Opti-MEM购自美国GIBCO公司;转染试剂LP2000购自美国Invitrogen公司;胎牛血清购自以色列Biological Industries公司;RNAiso Plus、PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自日本TaKaRa公司;蛋白提取、定量及Western blot相关试剂购自博士德生物工程有限公司;Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets购自美国Thermo Fisher Scientific;EZH2真核表达载体由西安基恩生物科技有限责任公司构建;EZH2干扰RNA由吉玛基因设计合成;EZH2抑制剂DZNep购自美国Peprotech公司;anti-α-SMA抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;anti-α-Tubulin抗体、anti-β-actin抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;anti-H3K27me3抗体、anti-EZH2抗体购自美国Cell Signal Technology;免疫荧光检测相关试剂购自碧云天公司;real-time PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 主要仪器

CO2细胞培养箱购自美国Thermo Scientific公司;台式高速冷冻离心机购自美国Eppendorf公司;蛋白电泳及Western blot相关仪器购自美国Bio-Rad公司;倒置荧光显微镜购自德国ZEISS公司;全自动酶标仪购自美国Bio-Tek公司;7500 Real-Time PCR System购自美国Applied Biosystems;全自动凝胶成像系统购自美国Protein Simple公司。

1.3 细胞培养、分组、药物处理及转染

大鼠肝星状细胞系HSC-T6培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中。状态良好的HSC-T6细胞传代到6孔板、24孔板或96孔板中,当细胞密度达到70%～80%时,进行药物处理或转染。

为研究姜黄素对HSCs活化的影响,HSC-T6分为对照组、TGF-β1组、姜黄素组;为研究EZH2过表达对HSCs活化的影响,HSC-T6分为对照组、TGF-β1组、EZH2过表达组;为研究EZH2抑制对HSCs活化的影响,HSC-T6分为对照组、TGF-β1组、EZH2敲降组和EZH2抑制剂组。

对照组正常培养;TGF-β1组加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1;姜黄素组加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1和40 μmol/L的姜黄素;EZH2过表达组加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1同时转染EZH2真核表达载体;EZH2敲降组加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1同时转染EZH2干扰RNA;EZH2抑制剂组加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1和1 μmol/L的EZH2抑制剂DZNep。EZH2真核表达载体和siRNA的转染按照Life Technologies公司细胞转染试剂Lipofectamine 2000的说明进行。

1.4 real-time PCR检测相关基因的转录水平变化

将各组培养板中的细胞弃掉培养液,加预冷PBS洗涤2次,用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA,经PrimeScript RT Master Mix反转录获得cDNA。以cDNA为模板,按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书进行real-time PCR检测。以β-actin作为内参,采用2-ΔΔCt的方法对α-SMA、Timp1、Col1a1、PPARγ、EZH2进行相对定量。各基因引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.5 Western blot检测相关基因蛋白表达水平的变化

将各组培养板中的细胞弃掉培养液,用预冷的PBS洗涤2次;加入适量预冷的PBS缓冲液,收集细胞,加入含有Protease and Phosphatase Inhibitor的RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白,BCA法进行蛋白定量。加等量的蛋白样品进行SDS-PAGE,转膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h;分别加抗α-SMA(1∶200)、抗EZH2(1∶1 000)的一抗,4 ℃孵育过夜,漂洗;加入抗α-Tubulin(1∶1 000)、抗β-actin(1∶1 000)的二抗室温孵育2 h,漂洗;加ECL发光液,凝胶成像系统进行拍照。

1.6 CCK-8法检测HSC-T6细胞增殖能力

HSC-T6细胞传代到96孔板中,对照组、TGF-β1组和姜黄素组分别按1.3方法处理,处理结束后利用碧云天的Enhanced Cell Counting Kit-8(增强型CCK-8试剂盒)进行测定,最后使用酶标仪在450 nm测定吸光度,计算细胞的增殖能力。

1.7 细胞免疫荧光技术检测EZH2过表达载体的表达及H3K27me3修饰水平的变化

HSC-T6细胞传代到6孔板中,对照组、TGF-β1组和姜黄素组分别按1.3方法处理,处理结束后的细胞加PBS轻摇漂洗2次,每次5 min;固定15 min,漂洗3次,每次5 min;封闭1 h,漂洗3次,每次5 min;加稀释后的抗H3K27me3(1∶500)的一抗,4 ℃孵育过夜;漂洗3次,每次5 min;加稀释的Cy3标记的二抗,室温孵育2 h;漂洗3次,每次5 min;加入DAPI室温避光染核10 min;PBS轻摇漂洗3次,每次5 min;加入适量的PBS,在荧光倒置显微镜下观察并拍照。检测EZH2过表达载体中EZH2的表达情况时加入抗EZH2(1∶500)的一抗。

1.8 核酸琼脂糖凝胶电泳检测EZH2的基因扩增情况

EHZ2的PCR扩增片段、EZH2真核表达载体及空载体进行1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后利用凝胶成像系统进行拍照。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 姜黄素对HSC-T6细胞增殖能力的影响

CCK-8法检测结果表明,与对照组相比,TGF-β1组的HSCs增殖能力提高(P<0.05);与TGF-β1组相比,姜黄素组HSCs增殖能力无显著改变(见图1)。

与对照组相比,*P<0.05图1 姜黄素对HSC-T6细胞增殖能力的影响Figure 1 Effect of curcumin on the proliferation of HSC-T6 cells

2.2 姜黄素抑制HSC-T6细胞纤维化相关基因的表达

real-time PCR结果显示,与对照组相比,TGF-β1组肝纤维化相关因子α-SMA,Timp1,Col1a1的表达显著上调(P<0.01);与TGF-β1组相比,姜黄素组肝纤维化相关因子的表达显著下调(P<0.01,见图2)。Western blot检测纤维化标志因子α-SMA的表达,得到了与real-time PCR相同的实验结果(见图2)。

与对照组比较,**P<0.01;与TGF-β1组比较,##P<0.01图2 姜黄素对HSC-T6细胞纤维化相关基因表达的影响Figure 2 Effect of curcumin on the expressions of liver fibrosis related genes in HSC-T6 cells

2.3 姜黄素促进HSC-T6细胞纤维化抑制因子PPARγ的表达

real-time PCR结果显示,与对照组相比,TGF-β1组纤维化抑制因子PPARγ的表达显著下调(P<0.01);与TGF-β1组相比,姜黄素组纤维化抑制因子PPARγ的表达显著上调(P<0.05,见图3)。

与对照组比较,**P<0.01;与TGF-β1组比较,#P<0.05图3 姜黄素对HSC-T6细胞纤维化抑制因子PPARγ表达的影响Figure 3 Effect of curcumin on the expression of liver fibrosis inhibitor PPARγ in HSC-T6 cells

2.4 姜黄素抑制EZH2表达及细胞内总H3K27me3水平

real-time PCR结果显示,与对照组相比,TGF-β1组组蛋白甲基化酶EZH2的表达显著上调(P<0.01);与TGF-β1组相比,姜黄素组EZH2的表达显著下调(P<0.01,见图4)。细胞免疫荧光检测结果显示,与对照组相比,TGF-β1组细胞内总H3K27me3水平升高;与TGF-β1组相比,姜黄素组细胞内H3K27me3的修饰水平下调(见图4)。该结果与EZH2的表达变化相一致,反映了姜黄素可能通过调控组蛋白甲基转移酶EHZ2的表达,进而影响HSC-T6细胞内H3K27me3的修饰水平。

2.5 EZH2真核表达载体构建及检测

核酸琼脂糖凝胶电泳及细胞免疫荧光检测结果表明,EZH2真核表达载体构建成功,转染HSC-T6细胞后可EZH2可高水平表达(见图5)。

2.6 过表达EZH2对HSC-T6细胞纤维化相关基因及抑制因子表达的影响

real-time PCR检测结果显示,与对照组相比,TGF-β1组肝纤维化相关因子α-SMA,Col1a1,Timp1的表达上调(P<0.01),PPARγ的表达下降(P<0.01);与TGF-β1组相比,EZH2过表达组α-SMA和Timp1的表达无显著变化,但Col1a1的表达上调(P<0.01),同时PPARγ的表达水平下调(P<0.05,见图6)。

图4 姜黄素对EZH2表达及细胞内总H3K27me3水平的影响Figure 4 Effect of curcumin on the expression of EZH2 and H3K27me3 level in HSC-T6 cells

图5 EZH2真核表达载体构建及鉴定Figure 5 Construction and identification of EZH2 eukaryotic expression vector

2.7 EZH2干扰RNA及EZH2抑制剂对HSC-T6细胞纤维化相关基因及抑制因子表达的影响

real-time PCR结果表明,吉玛基因设计合成的3条EZH2 siRNA均可显著降低HSC-T6细胞内EZH2的表达水平;Western blot结果表明mRNA水平抑制效率最高的EZH2-3 siRNA在蛋白表达水平也可显著抑制EZH2的表达(见图7)。real-time PCR检测结果显示,与对照组相比,TGF-β1组肝纤维化相关因子α-SMA,Col1a1,Timp1的表达显著上调(P<0.01),PPARγ的表达显著下调(P<0.01);与TGF-β1组相比,EZH2敲降组Timp1和Col1a1的表达无显著变化,但α-SMA的表达下调(P<0.05),同时PPARγ的表达上调(P<0.01);与TGF-β1组相比,EZH2抑制剂组下调α-SMA,Timp1的表达显著下调(P<0.01),但Col1a1的表达却上调(P<0.01),同时PPARγ的表达水平亦被上调(P<0.01,见图7)。

与NC-EZH2比较,△△P<0.01;与对照组相比,**P<0.01;与TGF-β1组相比,#P<0.05,##P<0.01图7 EZH2干扰RNA及EZH2抑制剂对HSC-T6细胞纤维化相关基因及抑制因子表达的影响Figure 7 Effect of EZH2 siRNA on the expressions of liver fibrosis-related genes and fibrosis inhibitor PPARγ in HSC-T6 cells

3 讨论

肝纤维化的本质为肝脏对各种慢性肝损伤的修复反应,但是在损伤修复过程中如果细胞外基质的合成与降解不平衡而导致细胞外基质过度沉积,则会导致肝纤维化的发生。肝纤维化的病因多样,包括酗酒、病毒感染、毒物、胆汁淤积、遗传性等,不同病因所致肝纤维化组织病理学形态及治疗手段不同,总的治疗原则为去除致病因素,逆转损伤。姜黄素作为中药姜黄的主要活性成分,可通过多种细胞和分子生物学机制起到保护和治疗肝病的作用,其机制可能与抑制炎性细胞因子活性、脂质过氧化物的产生、PI3K/Akt信号通路和HSCs的活化等相关[14]。有研究表明姜黄素能够防治和/或逆转肝脏的细胞病变并降低肝纤维化程度,同时可上调核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2 gene,Nrf2)的基因表达,推测其预防和治疗肝纤维化的机制可能与Nrf2的上调相关[15]。Hernández-Aquino等[16]研究发现姜黄素可减轻CCl4诱导的肝纤维化,降低JNK和Smad3的磷酸化水平,并导致活化HSCs的减少,因此达到抗纤维化的作用。HSCs活化是肝纤维化的关键,当肝脏受到各种病因所致的损伤时,肝细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞等会释放血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、TGF-β等细胞因子,通过旁分泌途径作用于HSCs,进而激活HSCs内一系列信号转导通路,如TGF-β/Smad途径、NF-κB途径、Wnt/β-catenin途径、JAK/STAT途径等,从而激活HSCs。活化的HSCs还可通过自分泌的方式被进一步活化并转分化为肌成纤维细胞[3,17-21]。本研究主要关注姜黄素是否通过影响EZH2的表达而影响HSCs的活化。

α-SMA是HSCs活化的重要标志,提示HSCs向肌成纤维细胞转分化,与肝纤维化的发生发展密切相关,在活化HSCs和肝纤维化中表达均上调[1]。Timp1是肝脏中重要的基质金属蛋白酶组织抑制剂,可抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的活性,使细胞外基质降解减少。通常情况下,Timp1在HSCs活化和肝纤维化时表达显著升高,可促进肝纤维化的形成[22]。Col1A1是细胞外基质的重要组成部分,在肝纤维化中表达显著上调,常被作为肝纤维化的标志基因。因此,本研究选取了以上3个基因作为HSCs活化的检测基因,结果表明TGF-β1处理使HSC-T6细胞中α-SMA、Col1a1和Timp1的表达升高,而姜黄素处理与TGF-β1的作用效果相反。说明TGF-β1可诱导HSCs活化,而姜黄素则会抑制HSCs的活化,可能对肝纤维化具有一定的治疗作用。

PPARγ具有多种生物学功能,在脂肪和葡萄糖的代谢调节、诱导肿瘤细胞分化和凋亡、抗动脉粥样硬化、抑制炎症等方面具有重要作用。此外,PPARγ可通过调控TGF-β和其他信号通路抑制HSCs活化及ECM的增加,从而达到抗纤维化的作用[23]。本研究表明TGF-β1处理使HSC-T6细胞中PPARγ的表达下降,而姜黄素处理与TGF-β1的作用效果相反。说明姜黄素可能通过上调PPARγ的表达进而达到抑制HSCs活化的目的。那么,PPARγ的上游调控因素又是怎么样的呢?Li等[24]研究发现,去乙酰化酶SIRT1可通过催化组蛋白甲基转移酶EZH2的去乙酰化而调节PPARγ的转录。EZH2表达的抑制和PPARγ表达的激活均可改善条件性敲除小鼠的纤维化。EZH2是一种组蛋白甲基转移酶,可催化组蛋白H3K27的三甲基化,通过改变组蛋白修饰调节其靶基因的表达水平。近年来,越来越多的研究表明EZH2与肝纤维化及HSCs的活化相关。Yang等[11]研究表明EZH2可通过催化DKK1的H3K27me3水平而抑制其表达,进一步激活了Wnt/β-catenin通路并最终促进了HSCs的活化。Martin-Mateos等[25]研究表明EZH2的表达在肝纤维化中显著升高,抑制EZH2表达可降低TGF-β诱导的HSCs中纤维化相关基因的表达,并减弱小鼠的肝纤维化程度。Lin等[26]研究发现丹酚酸B可通过抑制EZH2表达调控PTEN/Akt通路进而改善肾小管间质纤维化。本研究通过过表达和敲降EZH2表达来检测PPARγ的表达变化。结果表明转染EZH2真核表达载体使PPARγ的表达降低,同时肝纤维化相关基因Col1a1的表达升高;而转染EZH2干扰RNA和加入EZH2抑制剂DZNep处理则得到了相反的结果。

综上所述,本研究从细胞水平初步探索了姜黄素抑制肝纤维化的作用机制,结果表明姜黄素可通过抑制EZH2表达,从而上调PPARγ表达水平,进一步抑制HSCs活化,具有一定的理论和实际意义,为肝纤维化的防治提供了新思路及药物治疗的新靶点。但是,不同年龄、不同个体,甚至肝纤维化发展的不同阶段,HSCs及肝细胞内不同基因的表观修饰状态不尽相同,其对HSCs活化和肝纤维化的影响也会有所差异。因此,以上问题也会成为我们今后研究的重点内容。