布鲁菌抗原免疫层析检测方法的建立与应用

施远国，蒋永青，梁 彤，陈昌毅，李颖鑫，李 繁，柯艳坤，吴寒光，刘国华，何雪玉

(1.深圳市质量安全检验检测研究院，广东 深圳 518000；2.深圳市绿诗源生物技术有限公司，广东深圳 518172)

布鲁菌病(Brucellosis)简称布病，是一种重要的人畜共患传染病，在全国各地广为流行，会严重影响畜牧生产与人民群众的身体健康。妊娠母畜感染该病后，临床上典型的症状是流产，主要发生在怀孕后期，且主要发生于头胎母畜。公畜感染该病后会发生睾丸炎和附睾炎。布鲁菌病一年四季均可发生，其传染源主要为发病畜和带菌畜。该病主要在家畜间传播，以牛和羊为主。当发病或带菌母畜流产、分娩时，布鲁菌会随着流产胎儿、胎衣、羊水和子宫分泌物一起大量排出，成为致病性最强的传染源[1]。一头流产或正在分娩的发病母牛能够向环境排放109～1013个布鲁菌，这些细菌可感染60 000～600 000 头怀孕动物。此外，发病畜或带菌畜还会通过乳汁、粪便和尿液排出布鲁菌，污染草场、畜舍、饮水、饲料、排水沟等，导致病原菌扩散[2]。这些传染源长期存在于环境中，导致布鲁菌病防控难度加大，长期无法消灭，而且有愈演愈烈之势。因此，对布鲁菌病进行准确诊断，及时切断传染源，具有重要的公共卫生意义。

目前，我国对布鲁菌病防控使用的检疫方法主要是抗体检测[3]，但该方法的局限性在于难以判断单头畜体是否带菌、排泄物是否含布鲁菌。而布鲁菌抗原检测能方便、快速、准确地判定流产胎儿、分娩羊水、胎衣与母畜阴道分泌物是否存在布鲁菌，对布鲁菌病的防控具有巨大的促进作用。

因此，本研究利用抗布鲁菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS) 的O 链C 抗 原的单抗16C5，建立并开发胶体金免疫层析法，研制出针对布鲁菌病的检测卡，以期用于布鲁菌的快速检测。该方法对被检样本量需求少、操作方便、反应时间短，适合于广大基层单位、养殖场及大量检测样本的快速初筛，对布鲁菌病的防控和净化具有巨大的促进作用。

1 材料与方法

1.1 菌株

小肠结肠炎耶尔森菌O:9 全菌体，沙门菌O45-2(D 群)、C500(C1 群)和AE616(B 群)，大肠杆菌O157，均由深圳市绿诗源生物技术有限公司制备并提供。

1.2 主要试剂

布鲁菌单克隆抗体16C5 由深圳市绿诗源生物技术有限公司制备并保存，氯金酸购自Sigma 公司，硝酸纤维素(nitrocellulose，NC) 膜购自Sartrious 科学仪器(北京) 公司，玻璃纤维购自怀远县通成纸制品有限公司，聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)板购自南通浩杰特贸易有限公司，样本滴管购自沧州盛丰塑胶制品有限公司，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 购 自Roche公司，吸水纸购自怀远县通成纸制品有限公司，稀释液购自深圳市金灿华实业有限公司，布鲁菌核酸实时荧光PCR 检测试剂盒、布鲁菌M5-90 疫苗株购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

1.3 胶体金溶液的制备

取1 mL 1%氯金酸溶液，加入装有99 mL超纯水的锥形瓶中，制成0.01%氯金酸溶液，摇匀后放入智能加热套内加热至沸腾，迅速加入1.6 mL 的1%柠檬酸三钠溶液，摇匀，继续加热10 min 左右，直至溶液呈透亮的酒红色。停止加热，冷却至室温，用超纯水恢复至原体积，分装到棕色试剂瓶中，置于2～8 ℃下避光保存。

1.4 胶体金标记抗体16C5 最佳pH 的测定

取1.5 mL 的透明离心管，采用pH 梯度法，分别加入1 mL 金溶液，再缓慢加入0.2 mol/L的碳酸钾溶液，将胶体金溶液的pH 依次调为2.0、3.0、3.5、4.0、4.5 和5.0。随后，每管分别加入等量的10 μg 布鲁菌单抗16C5，调节每管单克隆抗体终浓度为10 μg/mL，振荡混匀，室温下静置标记20 min；当胶体金颜色未出现变化，且碳酸钾剂量最少时，即为胶体金和抗体16C5 结合的最佳pH。

1.5 金垫的制备

用金垫处理液浸泡玻璃纤维30 min，取出晾干，随后置于相对湿度为10%～30%的室温干燥房中烘干12～16 h。

1.6 喷金

将制备的金标布鲁菌抗体16C5 注入喷金仪中，调节喷金仪的参数为2.0 μL/cm，将胶体金溶液喷于处理好的玻璃纤维上。

1.7 样本垫的制备

用样本垫溶液浸泡玻璃纤维30 min，取出晾干，随后置于相对湿度为10%～30%的室温干燥房中烘干12～16 h。

1.8 胶体金试纸卡的制备

将反应膜、金垫、样本垫和吸水垫依次按顺序粘贴在PVC 底板上；样本垫的末端与金垫的始端相连，金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，且金垫和吸水垫与反应膜都有2 mm 的重叠，样本垫与金垫有2 mm 的重叠。样本垫的始端与用作底板的PVC 板的始端对齐，吸水垫的末端与用作底板的PVC 板的末端对齐；其中，反应膜上有检测线(T 线) 和质控线(C 线)，T 线和C 线的划线方向均为与长条状试纸卡的长端相垂直的条状带；T 线位于靠近样本垫末端的一侧；C线位于靠近吸水垫首端的一侧；组装好的试纸卡如图1 所示，将试纸卡用机器切成2.8 mm宽的小条，装在特制的密封袋中，4～30 ℃环境中保存。

1.9 判定标准

阳性(+)：C、T 线均显色，表示样本含有布鲁菌(图2A)；阴性(-)：T 线不显色，仅C线显色，表示样本不含有布鲁菌，或其含量低于检测阈值(图2B)；无效：C 线不显色，表明操作不正确，或检测卡已失效(图2C、2D)。

1.10 敏感性检验

将布鲁菌M5-90 疫苗株用稀释液进行10 倍系列稀释，布鲁菌含量为105、106、107、108、109CFU/mL，用制备好的布鲁菌抗原检测试纸卡进行检测，以肉眼能观察到T 线处有红色沉淀线的最低布鲁菌含量作为布鲁菌抗原检测试纸卡的敏感性。

1.11 特异性试验

用布鲁菌抗原检测试纸卡分别检测小肠结肠炎耶尔森菌O:9 全菌体，沙门菌O45-2(D群)、C500(C1 群)、AE616(B 群)，大肠杆菌O157 和布鲁菌M5-90 疫苗株，来评价布鲁菌抗原检测试纸卡的特异性。

1.12 重复性试验

用布鲁菌抗原检测试纸卡对布鲁菌阳性样本及阴性样本分别进行批内和批间重复性试验，每份样本重复8 次，比较不同批次间及批次内的重复性结果。

1.13 符合率试验

用布鲁菌抗原检测试纸卡检测临床采集的18 份样本，同时用布鲁菌核酸实时荧光PCR检测试剂盒对样本进行复检，并比较检测结果，评价两种方法的符合率。

1.14 临床样本的检测

用布鲁菌抗原检测试纸卡检测某地区送检的72 份临床样本，确诊送检样本是否含有布鲁菌，分析布鲁菌的阳性检出率。

2 结果与分析

2.1 胶体金标记抗体16C5 最佳pH 的测定

经测定，胶体金标记抗体16C5 最佳的pH为4.5(图3)。

2.2 敏感性试验

当布鲁菌M5-90 疫苗株稀释为105CFU/mL时，检测线处仍呈现肉眼可见的清晰的红色沉淀线(图4)，说明本研究制备的试纸卡对布鲁菌抗原有较高的敏感性。

图3 胶体金标记抗体16C5 最佳pH 结果

图4 布鲁菌抗原检测试纸卡敏感性检测结果

2.3 特异性试验

特异性试验显示，布鲁菌抗原检测试纸卡对布鲁菌M5-90 疫苗株检测为阳性(T 线显色)，而对沙门菌O45-2(D 群)、C500(C1 群)、AE616(B 群)、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌检测均为阴性(T 线不显色)，结果表明该试纸卡特异性较好(图5)。

2.4 重复性试验

用布鲁菌抗原检测试纸卡对布鲁菌阳性样本和阴性样本分别进行批内和批间重复性试验，结果显示，针对同一份样本，无论批间还是批内，检测结果均一致，重复性为100%，图6 为批内重复性检测结果。因此，本研究建立的布鲁菌抗原检测试纸卡具有良好的重复性。

图5 布鲁菌抗原检测试纸卡特异性检测结果

图6 布鲁菌抗原检测试纸卡批内重复性检测结果

2.5 符合率试验

用布鲁菌抗原检测试纸卡临床检测18 份样本，同时用布鲁菌核酸实时荧光PCR 检测试剂盒对样本进行复检，比较检测结果(表1)。结果显示，两种检测方法的符合率为94.4%[(12+5)/18]，敏感性为83.3%(5/6)，特异性为100%[(0+12)/12]，表明两种方法有很高的符合率。

2.6 临床样本的检测

用布鲁菌抗原检测试纸卡检测某地区送检的72 份临床样本。结果显示，布鲁菌阳性样本2 份，阴性样本70 份；布鲁菌的阳性检出率为2.8%，表明养殖户对布鲁菌的防控具有很高的认知。

3 讨论

布鲁菌病是一种由布鲁菌引起的人畜共患传染病，遍布全球各地，对畜牧业和人类公共卫生造成了巨大的威胁[4]。目前，在布鲁菌病的一般检测诊断方法中，细菌分离等方法是检测布鲁菌病的金标准，但是耗时长；酶联免疫吸附试验和一些分子生物学方法要求有专业实验室作为进行病原诊断的保障[5-7]。随着社会的不断进步，人民物质生活的不断丰富，高速的发展导致进出口检验检疫额度不断增加。这要求研究人员开发一些新技术去解决敏感性低、易发生交叉反应、耗时长、不易操作等问题。

本研究利用抗布鲁菌LPS 的O 链C 抗原的单抗16C5，建立开发胶体金免疫层析法，研制出针对布鲁菌病的检测试纸卡。该试纸卡与布鲁菌核酸实时荧光PCR 检测试剂盒的符合率为94.4%，敏感性为83.3%，特异性为100%，表明该试纸卡特异性强、敏感性高，能快速检测出未表现明显临床症状的感染牛，以切断布鲁菌病的流行和蔓延。布鲁菌抗原检测试纸卡的研制成功为我国布鲁菌的控制与根除提供了很好的技术支持。用制备好的试纸条对某地区送检的72 份临床样本进行布鲁菌检测，结果显示布鲁菌的阳性检出率为2.8%，表明养殖户对布鲁菌的防控具有很高的认知。

综上所述，本研究制备的布鲁菌抗原检测试纸卡能够快速、准确地检测感染布鲁菌的家畜。建议相关部门尽快将该方法纳入布鲁菌病诊断的相关标准中，以提高我国兽医的检测能力，促进家畜布鲁菌病的防控。