Maresin1通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻糖尿病大鼠视网膜神经炎症反应

张博，李凤君，刘学政，左中夫

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）主要由血管系统改变和炎症引起[1]。炎症的重要过程之一是细胞的快速迁移[2]。Müller 细胞是视网膜内主要的胶质细胞，其在糖尿病（diabetes mellitus，DM）病理生理过程中能被激活[3]。Müller细胞在DR中被激活的最显著迹象之一是胶质纤维酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）表达的增加[4]。Müller 细胞激活能促进炎性因子分泌，引发强烈的内源性炎症级联反应，引起DR的发生和发展[5]。

JAK/STAT 通路参与调节多种生物学效应[6]。JAK/STAT 通路激活能促进炎症，诱导多种反应[7]。研究表明，JAK/STAT 通路在DM 中被激活，其中JAK2/STAT3 亚型是目前研究最广泛和深入的一种[8]。但JAK2/STAT3通路对DR的影响尚不清楚。

Maresin1（MaR1）是从omega-3脂肪酸中提取的一种生物活性分子[9]，是一种在炎症缓解过程中活跃的脂质介质，在多种疾病中有抗炎效果。MaR1已被证明可通过对抗淀粉样β蛋白介导的炎症沉积，减缓慢性退行性疾病阿尔茨海默病的进展[10]。但MaR1是否参与DR炎症反应有待探讨。本实验拟探讨MaR1 及JAK2/STAT3通路是否参与DR的形成发展及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠40只，购自锦州医科大学实验动物中心[SCXK(辽)2019-003]，体质量180～200 g。将大鼠置于温度22～24 ℃、湿度50%～60%、12 h光/12 h暗循环的环境中，自由食水。实验遵循国家《实验动物管理条例》。

1.1.2 主要试剂与仪器 Maresin1购于Cayman公司；链脲佐菌素（STZ）购于Sigma 公司；JAK2/STAT3 通路激活剂colivelin 购于吉尔生化公司；JAK2、STAT3、p-JAK2、白细胞介素（interleukin，IL）-1 β 抗体购于Abcam 公司；p-STAT3、IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α抗体购于Affinity公司；HE染色试剂盒和Western blot 二抗购于Solarbio 公司；SP、DAB 试剂盒购于中杉金桥公司；ELISA 试剂盒购于MLBIO公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒购于Beyotime公司；倒置显微镜购于Olympus公司；石蜡切片机购于SLEE公司；水平电泳仪购于BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 DM大鼠模型建立及分组给药 大鼠适应性饲养数天，禁食水12 h，采用腹腔注射STZ（50 mg/kg）制备DM 大鼠模型[11]。3 d 后血糖≥16.7 mmol/L 的大鼠为造模成功，纳入后续研究。入组大鼠随机分为4组，每组10 只：对照组（Con 组）、糖尿病组（DM 组）、Maresin1预处理组（MaR1组）和Maresin1+colivelin组（colivelin 组）。DM 成模后，给与MaR1 组大鼠MaR1（4 ng/g）腹腔注射，2 次/周；Con 组和DM 组给予等量PBS注射[12]；colivelin组大鼠在MaR1组给药的基础上，将大鼠麻醉后用微量进样器向玻璃体内一次性注射colivelin 5 μL（10－4μmoL/L）[13]。12周后取材。

1.2.2 标本收集 采用戊巴比妥钠（10 g/L）腹腔注射麻醉大鼠。一部分大鼠用4%多聚甲醛灌流1.5～2 h，取眼球放至固定液中，置于－4 ℃冰箱48 h，将组织转移到蔗糖溶液中脱水后，石蜡包埋，备于HE 和免疫组化染色；一部分大鼠取新鲜视网膜组织进行ELISA 检测和Western blotting检测。

1.2.3 视网膜组织病理形态学检测 采用HE 检测视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）数量。眼球石蜡切片脱水后苏木素溶液染色5 min，盐酸乙醇分化30 s，伊红染色2 min，流水冲洗5 min，酒精和二甲苯溶液脱水透明，中性树胶封片。

1.2.4 免疫组织化学检测视网膜GFAP蛋白表达 眼球石蜡切片经二甲苯脱蜡、乙醇水合。抗原修复待恢复室温，3%H2O2避光反应10 min。PBS 清洗3 次。滴加山羊血清工作液30 min。用抗GFAP 抗体（1∶300）4 ℃孵育过夜（＞18 h）。次日复温1 h，二抗孵育1 h，PBS 清洗，链霉素亲和素孵育1 h。DAB 显色，苏木素复染。酒精和二甲苯溶液脱水透明。中性树胶封片。

1.2.5 ELISA 法测定视网膜组织IL-6、IL-1β和TNF-α含量 向新鲜视网膜中加入RIPA 裂解液，收集上清，于4 ℃、12000 rpm 离心20 min。按照说明书加液后37 ℃水浴60 min。弃去液体，每孔加入A 液B 液混匀后反应15 min。加入终止液，以450 nm波长测OD值。

1.2.6 Western blot检测视网膜组织IL-6、IL-1β、TNF-α、p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 蛋白表达水平收集上清同ELISA法。BCA试剂盒测定蛋白浓度。电泳、转膜。抗IL-6抗体（1∶1000）、抗IL-1β抗体（1∶2000）、抗TNF-α抗体（1∶1000）、抗p-JAK2抗体（1∶4000）、抗JAK2抗体（1∶5000）、抗p-STAT3 抗体（1∶4000）、抗STAT3 抗体（1∶5000）以及β-actin和GAPDH内参（1∶4000）在4 ℃孵育过夜（＞18 h）。次日用TBST洗膜，二抗（1∶5000）室温孵育2 h，ECL显影。用ImageJ软件分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件处理数据。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以（±s）表示，多组比较方法采用单因素方差分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MaR1改善了糖尿病大鼠视网膜形态

HE染色显示，Con组视网膜平整，RGC密集。DM组RGC 数量明显减少。与DM 组相比，MaR1 组RGC数量增多。colivelin 组较MaR1 组RGC 数量明显减少，见图1。

图1 大鼠视网膜HE染色

2.2 MaR1抑制了糖尿病大鼠视网膜GFAP的表达

免疫组织化学和Western blot 结果显示，DM 组大鼠的视网膜中，Müller 细胞大量被激活，GFAP 表达增多（P＜0.01）；MaR1 组大鼠视网膜GFAP 表达明显减少（P＜0.01）；Colivelin 组较MaR1 组GFAP 表达增多（P＜0.01），见图2、图3。

图2 免疫组化检测大鼠视网膜GFAP表达

2.3 MaR1 抑制了糖尿病视大鼠网膜炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达

ELISA和Western blot结果显示DM组IL-6、IL-1β、TNF-α的水平增高（P＜0.01）；MaR1 组IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平显著下降（P＜0.01）；与MaR1 组相比，colivelin组IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平上升（P＜0.01），见图4、图5。

图4 ELISA检测大鼠视网膜组织中IL-6、IL-1β、TNF-α因子的表达

图5 Western blot检测大鼠视网膜组织IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平

2.4 MaR1 抑制了糖尿病大鼠视网膜JAK2/STAT3 通路蛋白表达水平

Western blot 结果显示DM 组JAK2 和STAT3 磷酸化增加，p-JAK2 和p-STAT3 表达上调（P＜0.01）。MaR1 治疗12 周后，p-JAK2 和p-STAT3 表达下调（P＜0.01）。在MaR1 组基础上给予JAK2/STAT3 通路激活剂colivelin 后，MaR1 的保护作用被逆转（P＜0.01）。4组的JAK2、STAT3 总表达无改变。提示DM 大鼠的JAK2/STAT3 通路被激活，磷酸化增加，而MaR1 能有效抑制JAK2和STAT3磷酸化，见图6。

图6 Western blot检测大鼠视网膜组织p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的表达水平

3 讨论

近年来研究发现Müller 细胞参与了DR 的发病机制，被认为是神经血管功能障碍的一种形式[14,15]。炎症激活Müller 细胞并破坏组织稳态。在DR 的持续过程中，Müller 细胞中炎性细胞因子的产生和消除之间的微妙平衡被破坏，导致细胞损伤和疾病恶化[16]。在DR中，RGC 数量减少，同时GFAP 上调，视网膜神经胶质反应性增强，促进炎症细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的产生。MaR1 在DM 大鼠模型中抑制Müller 细胞炎症反应。因此，控制炎症反应可能对DM 患者预防或减轻视网膜损伤起到重要作用。

MaR1 是由巨噬细胞通过人12-脂氧合酶从二十二碳六烯酸中产生，具有强大的促分解和组织稳态作用[17]。文献报道促分解介质可以减轻DM 的疾病变化，包括炎症[18]。研究表明，MaR1 具有强大的抗炎和促解毒活性，包括抑制Müller 细胞的活化[19]。视网膜神经胶质细胞的激活与缺血、神经损伤、炎性因子等视网膜疾病引起的神经元损伤有关。此外，我们的研究发现MaR1 显著改善节细胞排列紊乱，抑制STZ 诱导的Müller细胞激活和炎症反应，并有助于DR的治疗。

炎症是Müller细胞激活和胶质细胞增生的首要反应，释放的大量因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等，引起炎症反应[3]。在DR 中，我们发现MaR1 可以降低GFAP的上调。但是MaR1 和JAK2/STAT3 通路激活剂colivelin 联合用药后，与MaR1 组相比，神经胶质细胞GFAP升高。免疫组化发现MaR1组较DM组的GFAP表达降低，而colivelin组较MaR1 组的GFAP 表达水平增加，所以MaR1可能是通过降低DR的Müller细胞激活减轻炎症。Müller 细胞是IL-1β产生的关键来源。神经胶质细胞对IL-1β极其敏感，并在这种促炎细胞因子的作用下迅速发展为细胞死亡。除了IL-1β，Müller细胞还产生其他促炎细胞因子如TNF-α和IL-6[20]。本研究以MaR1 处理DR 大鼠，降低了视网膜组织中IL-6、IL-1 β 和TNF-α 蛋白表达。然而，以MaR1 和JAK2/STAT3 通路激活剂colivelin 联合处理DR 大鼠，可增强IL-6、IL-1β和TNF-α炎症因子的释放，表明MaR1 抑制DR 大鼠炎症反应，是下调JAK2/STAT3 通路的因素。

JAK2/STAT3 信号通路的激活作为炎症中的一个重要信号，可促进神经胶质细胞的活化，在啮齿动物DR模型的进展中发挥关键作用[21]。但目前MaR1通过JAK2/STAT3 信号通路对DR 保护作用的影响尚未报道。本实验表明，DR 中p-JAK2 和p-STAT3 表达上调。在MaR1 治疗后，p-JAK2 和p-STAT3 表达下调。MaR1 和通路激活剂colivelin 联合干预后，p-JAK2 和p-STAT3蛋白表达较MaR1组明显下调，说明MaR1可能通过抑制JAK2 和STAT3 的磷酸化，下调JAK2/STAT3通路活性。

综上所述，本研究证实MaR1可抑制JAK2/STAT3信号通路的激活，减少GFAP和促炎因子的表达，有助于减轻DM 大鼠的视网膜损伤。MaR1 可能有助于减轻DM炎症的进展，是缓解DR的一种潜在新方法。