基于网络药理学和分子对接探究柴胡清肝汤治疗肉芽肿性乳腺炎的作用机制

谢 璐 万 华 吴雪卿 冯佳梅 高晴倩 瞿文超 邵士珺 孙佳晔

上海中医药大学附属曙光医院乳腺科，上海 200021

肉芽肿性乳腺炎（granulomatous mastitis，GM）是非哺乳期乳腺炎常见的类型之一，临床症见乳房肿块、红肿、疼痛等，可伴有发热、咳嗽、结节性红斑、关节炎等全身症状，病情反复，病程迁延，好发于非哺乳期、非妊娠期的中青年女性[1-2]。近年来发病率逐年递增，在全球其发病率占所有乳腺疾病的0.3%～1.9%，在发展中国家的发病率约占乳腺良性病变的4%～5%[3-5]。该病归属于中医学“粉刺性乳痈”范畴，1985 年顾伯华教授首次明确提出该病的概念并收录至《实用中医外科学》[6]。

肝经郁热证为该病常见的证型之一，临床表现为乳房结块红肿热痛、按之灼热，或化脓溃破，可伴发热、头痛、便秘、溲黄，舌质红、苔黄腻、脉弦数或滑数。《肉芽肿性小叶性乳腺炎中医诊疗专家共识（2021 版）》[7]、“十三五”规划教材《中医外科学》[8]等均推荐柴胡清肝汤治疗肝经郁热证GM，治拟疏肝清热、活血化瘀、调畅气机。

临床研究报道证实，柴胡清肝汤治疗可显著改善肝郁化热型急性进展期GM 中医证候评分，减轻乳房疼痛，缩小乳房肿块，有效率较高[9]。现代药理学研究表明，该方对肉芽组织增生有显著的抑制作用[10]。但柴胡清肝汤治疗GM 潜在的作用机制尚不明确，因此本研究运用网络药理学和分子对接的方法，探索该方的作用机制和潜在靶点，为临床治疗提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 柴胡清肝汤有效成分和相关靶点的筛选

在中药系统药理学分析平台（TCMSP，http: //tcmspw.com/tcmsp.php/）数据库中，分别以柴胡清肝汤12 味中药为关键词进行检索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（druglikeness，DL）≥0.18 作为限定条件，筛选得出该方的有效活性成分。运用Uniprot 数据库（https: //sparql.uniprot.org/）对靶点蛋白转化为标准名称。

1.2 GM相关靶点的获取及关键靶点的获取

以“granulomatous mastitis”为关键词在GeneCards（https: //www.genecards.org/）数据库中检索，获取疾病相关靶点。将药物有效成分靶点和疾病靶点导入Venny 2.1.0 绘制韦恩图，得到柴胡清肝汤治疗GM 的药物-疾病关键靶点。

1.3 柴胡清肝汤治疗GM靶点网络构建

将药物、有效成分、疾病相关靶点及其属性文件数据导入Cytoscape 3.9.1 中，绘制柴胡清肝汤与GM 的成分-疾病-靶点网络图。

1.4 交集靶点的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

将药物-疾病交集靶点输入STRING 数据库（https: //www.string-db.org）中，选择物种为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设定为“medium confidence（0.4）”，获得PPI 网络。将结果导入Cytoscape 3.9.1 中进行可视化处理。

1.5 GO富集和KEGG通路富集分析

将柴胡清肝汤治疗GM 的交集靶点导入DAVID 数 据 库（https: //david.ncifcrf.gov/），设置P＜ 0.05。GO 富集分析从生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MF）3 个模块进行。将富集结果的条目绘制成条形图和气泡图，由在线数据分析可视化平台（https: //www.bioinformatics.com.cn/）绘制。

1.6 关键靶点的分子对接验证

根据拓扑学参数Degree 值（度值）计算得出排名前5 位的核心活性成分，从TCMSP 数据下载MOL2 格式的3D 结构，将结构导入ChemBio3D Ultra 14.0 进行能量最小化；从PDB 数据库下载核心蛋白基因的3D 结构，使用Pymol 2.3.0 进行去除蛋白结晶水、原始配体等操作，利用AutoDocktools（v1.5.6）对核心活性成分和关键靶点进行加氢、计算电荷等操作并保存为pdbqt 格式。使用POCASA 1.1 预测蛋白结合位点，采用AutoDock Vina 1.1.2 进行对接。利用PyMOL 2.3.0 和Ligplot V2.2.5 对对接结果进行相互作用模式分析，根据结合能大小评估化合物与核心蛋白靶点的结合活性，选取结合能≤-5.0 kJ/mol 作为筛选条件，以评价两者的对接效果。

2 结果

2.1 柴胡清肝汤与GM作用靶点网络分析

经过筛选共获得柴胡清肝汤有效成分199个、有效成分靶点293 个、GM 疾病相关靶点79 个，其中有效成分和疾病交集靶点共23 个（图1）。通过Cytoscape 3.9.1 构建柴胡清肝汤与GM 可视化网络（图2），利用Network Analyzer 进行PPI 拓扑学参数分析，共得到478 个节点、4374 条边。以Degree值进行排序，药物活性成分排名前5 位的分别是（图3）：槲皮素（MOL000098，quercetin）、山柰酚（MOL000422，kaempferol）、β-谷甾醇（MOL000358，beta-sitosterol）、豆甾醇（MOL000449，stigmasterol）和黄芩素（MOL000173，wogonin），由此推测柴胡清肝汤可能通过以上有效成分在治疗GM 中发挥关键作用。

图1 柴胡清肝汤有效活性成分与GM 的交集靶点韦恩图

图2 柴胡清肝汤与GM 相互作用网络图

图3 排名前5 位的柴胡清肝汤有效成分

2.2 柴胡清肝汤治疗GM核心靶点分析及PPI网络的构建

将23 个交集靶点导入STRING 数据库进行PPI网络分析，经筛选后得到23 个节点、163 条边（图4）。将结果导入Cytoscape 3.9.1 中，利用Network Analyzer进行PPI 拓扑学参数分析，以Degree 值排序，取排名前10 位的节点为核心靶点，即IL-6、TNF、ALB、IL-1β、CXCL8、STAT3、CCL2、IL-4、IFNG、CRP，并绘制可视化网络图（图5），由此推测柴胡清肝汤作用于以上靶点发挥治疗GM 的作用。

图4 柴胡清肝汤治疗GM 关键靶点PPI 网络图

2.3 GO富集分析和KEGG通路富集分析

将23 个药物-疾病交集靶点导入DAVID 数据库中进行GO 富集分析，以P＜ 0.05 为筛选条件，BP 富集结果共129 个条目，CC 富集共9 个条目，MF 富集共13 个条目，根据Count 前10 位的富集结果作GO 功能富集分析图（图6）。结果显示，BP 主要包括炎症反应、基因表达的正向调控、对脂多糖的细胞反应、DNA 转录的正调控等；CC 主要包括细胞外空间、细胞外区域、外泌体、质膜等；MF 主要包括蛋白结合、相同蛋白质结合、细胞因子活性、酶结合、受体结合等。将Count 排名前15 位的KEGG核心通路构建KEGG 功能富集图（图7），主要包括IL-17、Toll 样受体、细胞因子受体相互作用、NF-κB、TNF 等信号通路。

图6 柴胡清肝汤治疗GM 交集靶点的GO 功能富集图

图7 柴胡清肝汤治疗GM 交集靶点的KEGG 通路富集图

2.4 柴胡清肝汤主要有效成分与关键靶点的分子对接

根据网络药理学分析结果，筛选Degree 值排名前5 位的有效活性成分槲皮素（MOL000098，quercetin）、山柰酚（MOL000422，kaempferol）、β- 谷甾醇（MOL000358，beta-sitosterol）、豆甾醇（MOL000449，stigmasterol）和黄芩素（MOL000173，wogonin），及Degree 值较大的作用靶点IL-6（PDB ID：1ALU）、TNF（PDB ID：2E7A）、IL-1β（PDB ID：6I8Y）、CXCL8（PDB ID：6N2U）、STAT3（PDB ID：6NJ2）、IL-4（PDB ID：2D48），进行分子对接，取结合能力最高的对接结果进行可视化处理（图8），结果显示关键活性成分与核心靶点的结合能均≤-5.0 kJ/mol。

图8 柴胡清肝汤有效活性成分与作用靶点的分子对接结果

3 讨论

GM 是一类好发于非哺乳期、非妊娠期的慢性乳腺化脓性疾病，归属于中医学“粉刺性乳痈”的范畴，病程迁延反复，复发率高，影响患者的身心健康和生活质量。目前，该病病因尚未明确，可能与自身免疫功能紊乱、细菌感染、乳头凹陷、高泌乳素血症等相关[11-13]。

肝经郁热证为该病临床最常见的证型之一，临床常用柴胡清肝汤加减治疗。柴胡清肝汤出自明代陈实功《外科正宗》，由柴胡、川芎、当归、赤芍、生地黄、黄芩、山栀、天花粉、防风、牛蒡子、连翘、甘草共12 味药物组成，诸药配伍，以“清消”为贵，发挥疏肝解郁、清热解毒、和营消肿的功效。现代药理学研究证实柴胡清肝汤可通过抑制IL-6、IL-2、IL-4、TGF-β 等促炎因子的表达，作用于NLRP3/IL-1β 通路抑制GM 的炎症发展[14]。

本研究基于网络药理学探究柴胡清肝汤治疗GM 的潜在作用靶点，共获得柴胡清肝汤有效活性成分199 个、有效成分靶点293 个、药物-疾病共同靶点23 个，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩素等有效活性物质可能作用于IL-6、TNF、ALB、IL-1β、CXCL8、STAT3、CCL2、IL-4、IFNG、CRP 等靶点，干预IL-17、Toll 样受体、细胞因子受体相互作用、NF-κB、TNF 等信号通路。分子对接结果显示，柴胡清肝汤中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等关键活性成分与核心靶点的结合能均≤-5.0 kJ/mol，验证了运用网络药理学初步探索柴胡清肝汤治疗GM 作用机制的可靠性。

GM 病理镜下表现为肉芽肿周围炎性细胞的致密集合[15]，免疫应答中起主要作用的是巨噬细胞，重要特征是单核/巨噬细胞的活化[16]。巨噬细胞具有高度的可塑性，暴露于不同的诱导环境时，功能上可极化为促炎性（M1）表型和修复性（M2）表型[17]。在炎症病理情况下，乳腺微环境稳态丧失，平衡倾向于促炎，引起巨噬细胞表型向M1 型极化。结合本研究关键靶点PPI 网络图、GO 功能富集图、KEGG 通路富集图的研究结果，柴胡清肝汤可能通过多靶点、多通路作用于M1/M2 巨噬细胞表型极化，调节多种下游多种炎症因子的表达，干预GM 的病程发展。

本研究运用网络药理学和分子对接的方法，从分子机制层面初步分析柴胡清肝汤治疗GM 的主要有效成分和作用机制，结果显示柴胡清肝汤可通过多成分、多靶点、多通路作用于GM 的疾病治疗，潜在的作用机制可能与调节巨噬细胞功能相关，但缺乏实验研究的验证，后续将对具体机制行进一步的科学探索和验证。