MMP-9抑制剂对人口腔鳞状细胞癌细胞系CAL27生物学行为影响机制的研究

王静璇， 刘红悦， 庄志征， 胡 燕， 杨英顺

（1.保定市第一中心医院口腔二科，保定 071000；2.衡水市第二人民医院口腔二科，衡水 053099；3.河北大学附属医院口腔科，保定 071030）

口腔鳞状细胞癌（OSCC）的定义为具有不同分化程度的浸润性上皮肿瘤，是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤[1]。目前在治疗方面取得了技术进步，大多数早期OSCC 患者可通过手术、化学疗法及放射疗法治疗，但随着诊断延迟，其5 年生存率不足60%；此外，继发性肿瘤每年3%～7%的形成率是其他恶性肿瘤所无法比拟的，并可能导致疾病复发[2-3]。据报道[4]，肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因，上皮间质转化（EMT）和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解过程涉及肿瘤迁移和侵袭，已成为近年来肿瘤转移研究的热点，积极探索癌症转移过程中的关键调控分子并加以干预可能是OSCC 治疗的潜力选择。基质金属蛋白酶（MMPs）在此过程中发挥积极作用，其还参与促生长信号释放、抗细胞凋亡、控制血管生成和新血管形成等促进恶性肿瘤发展过程[5]，提示MMPs 可能是OSCC 治疗的潜在靶点。BB-94 是一种广谱MMP 抑制剂，其可抑制基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的活性。研究[6]发现，BB-94 的治疗降低了食管鳞状癌细胞的生长、迁移和EMT，但关于BB-94 对OSCC 的相关报道较少。PI3K/Akt 通路在调节细胞生长和代谢中起关键作用，研究[7]发现，该通路失活可抑制OSCC 细胞EMT。为探究BB-94 对OSCC 的干预作用及是否涉及PI3K/Akt 通路，本实验以体外培养的人OSCC 细胞系CAL27 为研究载体，并探讨BB-94 对CAL27 细胞恶性生物学行为的影响及可能的作用机制，以期为OSCC 发病机制及治疗手段提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人OSCC 细胞系CAL27 购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2 试剂和仪器 BB-94（APExBIO 公司，美国）；Matrigel 基质胶（BD 公司，美国）；明胶（Sigma 公司，美国）；AnnexinV-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)流式细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技公司，中国）；DMEM 培养液、胎牛血清（Gibco 公司，美国）；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、N-钙黏蛋白（N-cad）、MMP-9、E-钙黏蛋白（E-cad）、波形蛋白（Vim）抗体（Abcam 公司，美国）；全自动酶标仪（Bio-Rad 公司，美国）；实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）仪（赛默飞世尔科技有限公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 DMEM 完全培养液（含10%胎牛血清、100 μg/mL 链霉素、100 U/mL 青霉素）复苏CAL27细胞，以1×105个/mL密度接种至培养瓶中，于37 ℃、5% CO2及饱和湿度环境条件下的培养箱中培养，待细胞生长至80%左右时即进行传代，传代2～3 次。

1.2.2 明胶酶谱实验检测MMP-9 活性 利用不含胎牛血清的DMEM 条件培养液（200 μL）以每孔1×105个的细胞密度将CAL27 细胞接种至24 孔板，培养48 h 后，收集细胞上清液。7 μL 上清液与2×样品缓冲液[pH 8.0、125 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、4%十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）及0.05%溴酚蓝]室温孵育10 min，加样至含1 mg/mL 明胶的10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro-phoresis，SDS-PAGE）凝胶中，125 V 恒压分离蛋白至示踪染料到凝胶底部，孵育凝胶于复性缓冲液后置于显影缓冲液中平衡，考马斯亮蓝R-250 染色30 min，后用10%乙酸和10%的异丙醇脱色。用凝胶成像分析系统进行扫描，以0 μg/mL BB-94 组细胞做对照，以条带面积×平均吸光度值反映MMP-9 活性。

1.2.3 细胞计数试剂盒-8(CCK-8)实验检测BB-94对CAL27 细胞存活率的影响 收集对数期细胞，利用含0（对照组）、0.125、0.25、0.5 及1.0 μg/mL BB-94（实验组）的DMEM 条件培养液重悬，并以2×104个/mL 密度接种100 μL 细胞悬液于96 孔板中，每个浓度各5 个复孔。培养箱内培养48 h 后，弃去培养液加入含10 μL CCK-8 溶液的DMEM 完全培养液，继续培养2 h。全自动酶标仪测定450 nm 处的吸光度值，细胞存活率（%）=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%，重复3 次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集对数期细胞，利用含0、0.125、0.25、0.5、1.0 μg/mL BB-94 的DMEM 条件培养液重悬，以1×105个/mL 的密度接种2 mL 细胞悬液于6 孔板中，每个浓度各5 个复孔。培养箱内培养48 h 后收集细胞，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤3 次，结合缓冲液重悬，5 μL Annexin V-FITC 溶液、5 μL PI 溶液避光染色15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率，重复3 次。

1.2.5 伤口愈合实验检测细胞迁移能力 收集对数期细胞，DMEM 完全培养液重悬，以1×105个/mL 密度接种2 mL 细胞悬液于6 孔板中。待培养至汇合，10 μL 移液枪头制造划痕，PBS 洗涤细胞3 次后利用含0、0.125、0.25、0.5、1.0 μg/mL BB-94 的无血清DMEM 培养液培养48 h，在划痕后0 h 和48 h 时拍照并利用Image J 软件（Rawak Software 公司，德国）测量划痕宽度，划痕愈合率代表细胞迁移能力，划痕愈合率=（0 h 划痕宽度-48 h 划痕宽度）/0 h 划痕宽度×100%，重复3 次。

1.2.6 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 以每孔1×105个细胞密度接种CAL27 细胞至Transwell 6孔板上室（涂布有matrigel 基质胶），加入1 mL 对应无血清培养液；于Transwell 6 孔板下室加入2 mL含10%胎牛血清的对应培养液，48 h后弃去培养液，4%多聚甲醛固定，PBS 洗涤后结晶紫染色10 min，PBS 洗涤3 次，镜下观察并计数侵袭细胞数量，重复3 次。

1.2.7 RT-qPCR 技术检测PI3K、Akt mRNA 相对表达水平 细胞分组及培养同步骤1.2.3。TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，检测其浓度及纯度后逆转录为cDNA。制备RT-qPCR 反应体系，反应条件为95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 个循环，72 ℃ 60 s。以GAPDH 为内参，2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。用Primer Premier 5.0 软件（Premier 公司，加拿大）设计引物，送至河北华大基因细胞科技有限公司合成。引物序列PI3K：正向引物5'-ACGCTTTCAAACGCTATCTCC-3'，反向引物5'-CTGATGAGGTATGCTAGG CGA-3'；Akt：正向引物5'-GAGGATCTTCATGGCGTAGTAG-3'，反向引物5'-TG ACCATGAACGAGTTTGAGTA-3'；β-actin：正向引物：5'-CAGGAGGCATTGCT GATGAT-3'，反向引物5'-GAAGGCTGGGGCTACTTT-3'。

1.2.8 Western blotting 检测相关蛋白相对表达情况 细胞分组及培养同步骤1.2.3。PBS 洗涤2～3 次，收集细胞沉淀，裂解缓冲液振荡裂解，4 ℃下12 000 r/min 离心10 min 后取上清液。测定细胞全蛋白浓度，12.5% SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，蛋白转移至PVDF 膜，1×TBST 洗膜3 次，每次10 min，0.05 g/mL 脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗（均1︰1 000 稀释）于4 ℃下孵育过夜，洗膜，二抗（1︰8 000 稀释）室温孵育2 h，洗膜，增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）液与PVDF 膜反应1～2 min，化学发光凝胶成像系统曝光并拍照记录。用Image J 软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参β-actin 灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

利用SPSS 26.0 软件进行数据统计学处理，多计量资料比较采用单因素方差分析，2 组间比较采用LSD-t检验，计量结果均以平均数±标准差（x±s）表示。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BB-94 对CAL27 细胞MMP-9 相对活性的影响

不同浓度BB-94 作用下的CAL27 细胞MMP-9相对活性比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。CAL27 细胞MMP-9 相对活性均随BB-94 作用浓度增大而降低（P<0.05）。详见图1、表1。

表1 CAL27 细胞MMP-9 相对活性比较（）Table 1 Comparison of MMP-9 relative activity of CAL27 cells()

表1 CAL27 细胞MMP-9 相对活性比较（）Table 1 Comparison of MMP-9 relative activity of CAL27 cells()

①表示P<0.05，与0 μg/mL 组比较；②表示P<0.05，与0.125 μg/mL组比较；③表示P<0.05，与0.25 μg/mL 组比较；④表示P<0.05，与0.5 μg/mL 组比较。

图1 各浓度BB-94 作用下的CAL27 细胞MMP-9 明胶酶谱Figure 1 MMP-9 gelatinase spectrum of CAL27 cells at different concentrations of BB-94

2.2 BB-94 对CAL27 细胞增殖的抑制情况

不同浓度BB-94 作用下CAL27 细胞存活率比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。CAL27 细胞存活率随BB-94 浓度增大而降低（P<0.05）。详见表2。

表2 不同浓度BB-94 培养下CAL27 细胞存活率比较（）Table 2 Comparison of survival rates of cal27 cells cultured with different concentrations of BB-94 ()

表2 不同浓度BB-94 培养下CAL27 细胞存活率比较（）Table 2 Comparison of survival rates of cal27 cells cultured with different concentrations of BB-94 ()

①表示P<0.05，与0 μg/mL 组比较；②表示P<0.05，与0.125 μg/mL组比较；③表示P<0.05，与0.25 μg/mL 组比较；④表示P<0.05，与0.5 μg/mL 组比较。

2.3 BB-94 对CAL27 细胞凋亡的影响

不同浓度BB-94作用下CAL27细胞凋亡率比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。CAL27 细胞凋亡率随BB-94 浓度增大而升高（P<0.05）。详见图2、表3。

表3 不同浓度BB-94 培养下CAL27 细胞凋亡率比较（）Table 3 Comparison of apoptosis rates of CAL27 cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

表3 不同浓度BB-94 培养下CAL27 细胞凋亡率比较（）Table 3 Comparison of apoptosis rates of CAL27 cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

①表示P<0.05，与0 μg/mL 组比较；②表示P<0.05，与0.125 μg/mL组比较；③表示P<0.05，与0.25 μg/mL 组比较；④表示P<0.05，与0.5 μg/mL 组比较。

图2 流式细胞仪检测各浓度BB-94 作用下CAL27 细胞的凋亡情况Figure 2 Apoptosis of CAL27 cells at different concentrations of BB-94 detected by flow cytometry

2.4 BB-94 对CAL27 细胞迁移能力的影响

不同浓度BB-94 作用下CAL27 细胞划痕愈合率比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。CAL27细胞划痕愈合率随BB-94 作用浓度增大而降低（P<0.05）。详见图3、表4。

表4 不同浓度BB-94 培养下CAL27 细胞划痕愈合率比较（）Table 4 Comparison of wound healing rates of CAL27 cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

表4 不同浓度BB-94 培养下CAL27 细胞划痕愈合率比较（）Table 4 Comparison of wound healing rates of CAL27 cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

①表示P<0.05，与0 μg/mL 组比较；②表示P<0.05，与0.125 μg/mL组比较；③表示P<0.05，与0.25 μg/mL 组比较；④表示P<0.05，与0.5 μg/mL 组比较。

图3 各浓度BB-94 作用下CAL27 细胞迁移情况(×20)Figure 3 Migration of CAL27 cells at various concentrations of BB-94 (×20)

2.5 BB-94 对CAL27 细胞侵袭能力的影响

不同浓度BB-94 作用下CAL27 侵袭细胞数比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。CAL27 侵袭细胞数随BB-94 作用浓度增大而减少（P<0.05）。详见图4、表5。

表5 不同浓度BB-94 培养下CAL27 侵袭细胞数比较（）Table 5 Comparison of CAL27 invasive cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

表5 不同浓度BB-94 培养下CAL27 侵袭细胞数比较（）Table 5 Comparison of CAL27 invasive cells cultured with different concentrations of BB-94 (()

①表示P<0.05，与0 μg/mL 组比较；②表示P<0.05，与0.125 μg/mL组比较；③表示P<0.05，与0.25 μg/mL 组比较；④表示P<0.05，与0.5 μg/mL 组比较。

图4 各浓度BB-94 作用下CAL27 细胞侵袭情况（×200）Figure 4 Invasion of CAL27 cells at various concentrations of BB-94 (×200)

2.6 BB-94 对CAL27 细胞PI3K、Akt mRNA 表达的影响

不同浓度BB-94 作用下CAL27 细胞PI3K、Akt mRNA 相对表达水平比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。CAL27 细胞PI3K、Akt mRNA 相对表达水平均随BB-94 作用浓度增大而降低（P<0.05）。详见表6。

表6 CAL27 细胞PI3K、Akt mRNA 相对表达水平比较（）Table 6 Comparison of relative expression levels of PI3K and Akt mRNA in CAL27 cells ()

表6 CAL27 细胞PI3K、Akt mRNA 相对表达水平比较（）Table 6 Comparison of relative expression levels of PI3K and Akt mRNA in CAL27 cells ()

①表示P<0.05，与0 μg/mL 组比较；②表示P<0.05，与0.125 μg/mL组比较；③表示P<0.05，与0.25 μg/mL 组比较；④表示P<0.05，与0.5 μg/mL 组比较。

2.7 BB-94 对CAL27 细胞中相关蛋白表达的影响

不同浓度BB-94 作用下CAL27 细胞中PI3K、p-Akt、Vim、N-cad、MMP-9 及E-cad 蛋白相 对表达水平比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。CAL27细胞中PI3K、p-Akt、Vim、N-cad 及MMP-9 蛋白相对表达水平随BB-94 作用浓度增大而降低，E-cad蛋白相对表达水平随BB-94 作用浓度增大而升高。详见图5、表7。

表7 CAL27 细胞PI3K 等蛋白相对表达水平比较（）Table 7 Comparison of relative expression levels of PI3K and other proteins in CAL27 cells (())

表7 CAL27 细胞PI3K 等蛋白相对表达水平比较（）Table 7 Comparison of relative expression levels of PI3K and other proteins in CAL27 cells (())

①表示P<0.05，与0 μg/mL 组比较；②表示P<0.05，与0.125 μg/mL 组比较；③表示P<0.05，与0.25 μg/mL 组比较；④表示P<0.05，与0.5 μg/mL组比较。

图5 各浓度BB-94 作用下CAL27 细胞相关蛋白Western blotting 条带图Figure 5 Western blotting banding of CAL27 cell related proteins at various concentrations of BB-94

3 讨论

恶性肿瘤的特征之一是具有内在的ECM 降解活性，ECM 是肿瘤转移的重要组织屏障，其基底膜屏障被破坏将支持侵袭发生[8]。MMPs 为锌依赖性内切蛋白酶家族，可参与ECM 中各种蛋白质的组织重塑和降解过程，为胶原蛋白降解中的主要ECM酶[9]，其失调可导致癌症标志的关键信号通路失衡，维持增殖信号转导，逃避生长抑制因子和细胞死亡抗性，从而实现复制永生，因而被视为潜在的抗癌药物靶标[10]。

MMP-9 是由旁分泌癌细胞分泌的明胶酶，与另一种明胶酶MMP-2 不同，MMP-9 是可诱导的，且在正常成人组织中检测不到其活性，它的表达被视为肿瘤侵袭的主要先决条件[11]。有研究[12]发现，MMP-9 表达存在于所有OSCC 病例中，且实质中MMP-9 的染色强度强于肿瘤基质。在OSCC 中，MMP-9 可通过破坏基底膜促进肿瘤进展并实现转移，其过表达被证明在OSCC 中具有预后价值[13]。BB-94 为广谱MMPs 抑制剂，可显著抑制MMP-9 活性及表达[14]。研究[15]发现，BB-94 可降低肝肿瘤动物模型射频消融后的肿瘤生长并抑制其侵袭性，可通过下调MMP-9 表达抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移[16]。本研究结果显示，BB-94 可显著抑制OSCC细胞系CAL27 细胞中MMP-9 活性，抑制CAL27 细胞增殖并促进其凋亡，并可降低CAL27 细胞伤口愈合及迁移能力，提示BB-94 可能通过下调MMP-9活性降低癌细胞对ECM 穿透能力及屏障降解损伤作用，进而抑制OSCC 癌细胞的恶性生物学行为。

EMT 是癌症发展和转移第一阶段的关键机制，可启动和维持涉及一系列关键转录因子、MMPs 及下游途径的有序激活，从而利于改变细胞间黏附和ECM 重塑，并最终导致ECM 内的侵入性迁移[17]。EMT 特征是细胞的上皮特性丧失，如黏附和上皮标志物E-cad 的表达，而获得间充质特性，如增加细胞运动和间充质标志物N-cad 和Vim 的上调[18]。MMP-9 通过其对E-cad 的蛋白水解作用和伴随的Vim 和N-cad 丧失而作为EMT 诱导剂[10]。本研究结果显示，BB-94 可显著抑制CAL27 细胞中Vim 及N-cad 蛋白表达，上调E-cad 蛋白相对表达水平，提示BB-94 可能通过抑制MMP-9 表达抑制CAL27 细胞的EMT 转化。研究[19]发现，抗EMT 特性与抑制MMP-9 相关信号通路激活有关。PI3K/Akt 通路被认为是参与肺癌细胞转移和EMT 关键机制之一，与肾细胞癌细胞增殖和转移有关，另可调节人咽部鳞状细胞癌细胞凋亡，据报道抑制该信号通路可减轻OSCC 的发展[20]。Liu 等[21]的研究结果显示，肿瘤相关巨噬细胞分泌的MMP-9 通过PI3K/Akt 通路促进胃癌转移；Jiang 等[22]研究表明，PI3K/Akt 通路可激活EMT 并促进OSCC 进展。本研究结果显示，BB-94 可显著降低PI3K、Akt mRNA 相对表达水平，并下调PI3K 及p-Akt 蛋白表达，提示BB-94 可能通过下调MMP-9 表达抑制PI3K/Akt 信号通路激活，减缓EMT 进展，进而发挥一系列抗CAL27 细胞恶性生物学行为作用。

综上所述，BB-94 可抑制人OSCC 细胞系CAL27细胞的恶性生物学行为，其作用机制可能与下调MMP-9 表达，进而抑制PI3K/Akt 信号通路激活的EMT 进展有关。