两种方法检测先天性心脏发育异常胎儿的染色体结果分析

赵丹阳，杨微微，王文靖，鞠明艳，任晨春

（1.天津医科大学研究生院，天津 300070；2.天津市中心妇产科医院检验科，天津 300199）

先天性心脏发育异常（CHD）是最常见的人类先天性畸形之一[1]，是新生儿发病和死亡的主要原因。随着超声诊断技术和外科技术的提高，越来越多的胎儿期CHD 得到早期诊断和治疗，如何尽早确定胎儿CHD 的病因，进行个性化处理是产前诊断面临的主要问题。虽然CHD 的病因存在异质性，但仍有大约20%的CHD 可以归因于染色体异常、单基因缺陷或环境因素[2]。本研究探讨拷贝数变异测序（copy number variation sequencing，CNV-seq）技术联合核型分析技术在产前诊断胎儿期CHD 染色体异常的应用价值，为临床决策提供技术支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2019 年2 月至2022 年8 月在超声科诊断为胎儿CHD 的单胎孕妇60 例，孕妇年龄18～45 岁，平均年龄（30.58±4.97）岁，孕周18～24 周，平均孕周为（21.70±2.25）周。所有孕妇均接受羊膜腔穿刺，对胎儿进行核型分析，同时行CNV-seq检测。纳入标准：（1）超声科由一名具有副高及以上职称的专业医师进行超声心动检查，检测房室与大血管的关系，提示胎儿存在心脏及大血管结构异常。（2）夫妻双方均在医院产前诊断门诊进行遗传咨询，了解有创产前诊断的风险并签署知情同意书。（3）术前进行血常规、血生化、血凝及传染病病原体筛查，无穿刺禁忌证。此项目经院级专家伦理委员会审批通过，伦理编号为2020KY080。

1.2 研究方法

1.2.1 羊膜腔穿刺术 严格遵循无菌操作，在超声引导下行羊膜腔穿刺术，分别抽取2 管10 mL 羊水和1 管3 mL 羊水。

1.2.2 胎儿羊水细胞培养及核型分析 将获得的2 管10 mL 羊水，1 500×g离心10 min 后分离羊水细胞，留取1 mL 沉淀混匀后分别接种于两瓶含3 mL 培养基的培养瓶中，7～9 d 后换液，继续培养48 h，加入0.3 mL 秋水仙素（20 μg/mL），培养2 h 后采用胰酶消化法收获，进行G 显带染色，必要时进行C 显带或者N 显带，按照ISCN2020 版标准，计数30个，分析5 个分散好、中等长度的中期分裂相。

1.2.3 胎儿羊水细胞CNV-seq 检测 将抽取的1管3 mL 羊水，使用北京贝瑞和康公司提供的科安试剂盒，按照标准流程进行操作：DNA 提取→酶反应→纯化→文库纯化→文库质控→测序→生物信息分析。结果判读参照人类基因组hg19 版本和DGV、DECI-PHER、OMIM、UCSCS 及PubMed 等数据库，判定为良性CNVs、可疑良性CNVs、临床意义不明确的CNVs（VOUS）、可疑致病性CNVs 和致病性CNVs。对检测到亚显微结构异常的致病性CNVs和可疑致病的CNVs，建议胎儿父母行CNV-seq 检测，以明确变异的遗传性质及相关临床意义。

1.3 统计学处理 对于临床数据采用SPSS 25 软件分析，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胎儿超声检测结果 60 例CHD 胎儿中，23 例是独立性CHD，其中10 例为室间隔缺损；37 例不仅有CHD，还伴有心外结构/软指标异常，其中合并脑部异常10 例，泌尿系统异常3 例，消化系统异常2 例，其他畸形包括合并唇腭裂、长骨短小、多指/趾或并指/趾共16 例，单脐动脉6 例（表1）。

表1 60 例CHD 胎儿超声结果分类表Tab.1 Ultrasound results of 60 fetuses with CHD

2.2 两种方法检测CHD 胎儿染色体结果分析 60例CHD 胎儿均行核型分析和CNV-seq 检测，发现染色体异常20 例，染色体异常检出率33.3%。其中核型分析与CNV-seq 结果一致检出11 例，包括9 例数目异常和1 例衍生染色体及1 例嵌合体；两种方法检出不一致9 例，其中核型分析检出2 例平衡性结构异常，CNV-seq 未能检出；7 例CNV-seq 检出为微缺失/微重复综合征，核型分析未见明显异常（表2）。

表2 两种方法检测染色体异常CHD 胎儿结果分析Tab.2 Analysis of the results of chromosome abnormality of fetus with CHD by two methods

核型分析检出染色体异常例数为13 例，其中数目异常9 例，包括4 例47，XX/XY，+21，3 例47，XX/XY，+18，1 例45，X，1 例47，XXY；结构异常4例，包括罗氏易位45，XY，der（14；21）（q10；q10）1例，平衡易位46，XY，t（8；15）（p10；q10）1 例，衍生染色体1 例，核型为46，XY，der（18）dup（18）（q11.2-q23），嵌合体1 例，47，XY，+mar[16]/46，XY[19]。

CNV-seq 检测异常CNVs 例数为18 例，其中数目异常9 例，同核型结果一致。存在微缺失/微重复异常9 例，1 例核型结果为衍生染色体的患者CNV-seq 检测结果为dup（18）（q11.2q23）6.7 Mb；1例核型分析为47，XY，+mar[16]/46，XY[19]嵌合体，经CNV-seq 证实为dup（22）（q11.1q11.21）1.7 Mb，确定了核型分析中marker 来源于22 号染色体；7例核型分析结果正常的患者CNV-seq 表现为微缺失/微重复，分别为dup（18）（q23）1Mb，dup（1）（p36.13）1.1 Mb，dup（22）（q11.21）2.55 Mb，4 例为del（22）（q11.21）2.65-2.7 Mb。所有CNVs 结果通过检索UCSC、DECIPHER、OMIM、Clin Var、DGV、PUB -MED数据库，发现致病性CNVs 6 例，可疑致病性CNVs 3 例（表3）。

表3 7 例CNV-seq 微缺失/微重复患者临床表现Tab.3 Clinical manifestations of CNV-seq microdeletion/microduplication in 7 patients

2.3 不同类型CHD 胎儿的染色体异常结果分析伴心外结构/软指标异常CHD 组染色体异常率高于独立性CHD 组，但两组间比较差异无统计学意义[37.8%（14/37）vs.26.1%（6/23），χ2=1.76，P>0.05]，见表4。

表4 两组CHD 胎儿染色体异常检出率比较Tab.4 Comparison of detection rates of fetal chromosomal abnormalities in CHD between the two groups

23 例独立性CHD 中6 例有染色体异常：4 例表型为室间隔缺损，染色体结果分别为2 例21 三体，1 例罗氏易位，1 例平衡易位；1 例左心发育不良，染色体结果为1p36.13 存在1.1 Mb 重复；1 例三尖瓣狭窄、肺动脉瓣闭锁，染色体结果为18q23 存在1 Mb 重复。

37 例CHD 合并心外结构/软指标异常中14 例有染色体异常：染色体数目异常占7 例，染色体结果分别为18 三体3 例，21 三体2 例，45，X 和47，XXY 各1 例，这7 例中5 例表现为神经系统异常（脉络丛囊肿或脑积水），2 例为消化系统畸形。染色体结构异常7 例，1 例核型46，XY，der（18）dup（18）（q11.2q23），胎儿表型为复杂性先心病，同时合并肾囊肿；1 例核型47，XY，+mar[16]/46，XY[19]，CNVseq 证实为dup（22）（q11.1q11.21）1.7 Mb，结合核型分析结果，考虑marker 为2 倍的22q11.1q11.21 结合后形成的新的染色体片段，表型为室间隔缺损伴消化系统畸形；其余5 例中4 例为22q11.2 微缺失综合征，心脏畸形均为圆锥动脉干异常，心外异常表现为脉络丛囊肿/脑积水、唇腭裂、长骨短小、单脐动脉，1 例为22q11.2 微重复综合征，重复片段大小为2.55 Mb，CHD 类型为三尖瓣狭窄，心外异常为脉络丛囊肿。

3 讨论

CHD 胎儿染色体异常率在10%～30%[3-4]。本研究中胎儿CHD 染色体异常率为33.3%（20/60）。染色体异常包括数目异常和结构异常。其中21 三体、18 三体和13 三体是造成CHD 的染色体数目异常最常见病因，其他常见病因还包括染色体微缺失/微重复综合征等[5-6]。

本研究CHD 胎儿检出染色体异常共20 例，其中核型分析与CNV-seq 结果一致检出11 例，包括9 例数目异常、1 例衍生染色体及1 例嵌合体；两种方法检出不一致9 例，其中核型分析独立检出2 例平衡性结构异常，CNV-seq 独立检出7 例微缺失/微重复综合征。两种方法检出率不一致与其方法局限性有关。在胎儿染色体检测方面，核型分析是检测的“金标准”，对染色体数目异常和大片段结构缺失或重复有较高的诊断率，特别是可以检出易位、倒位、插入等平衡性结构异常，相对于分子诊断具有绝对性优势[7]。但是核型分析也存在很多短板，比如检测周期长，无法检测5～10 Mb 以下微缺失/微重复，存在羊水培养失败可能，受到从业人员经验水平限制，存在一定的误差。而CNV-seq 作为第二代低深度高通量测序技术检测样本范围广，无需培养，可发现小片段微缺失/微重复，2 周左右即可出具报告，节约时间成本。所以CNV-seq 技术是核型分析的有效补充，提高染色体异常的检出率。

本研究60 例CHD 胎儿中，分为伴心外结构/软指标异常CHD 组和独立性CHD 组，染色体异常率在两组间差异没有统计学意义，可能与本研究选取样本量过小相关。23 例独立性CHD 中染色体异常6 例，2 例为21 三体，1 例为罗氏易位，1 例平衡易位，另外2 例微重复综合征，通过CNV-seq 检测得出。37 例CHD 合并心外结构/软指标中14 例有染色体异常，核型检出率为64.3%（9/14），明显低于CNV-seq 检出的检出率100%（14/14）。其中值得注意的是，1 例核型结果为18 号染色体的衍生染色体，核型为46，XY，der（18），通过CNV-seq 检测确定是18 号染色体的重复，重复片段为q11.2q23。1 例核型分析存在低比例嵌合，并发现标记染色体，核型47，XY，+mar[16]/46，XY[19]，CNV-seq 结果为22q11.1q11.21 长度为1.7 Mb 的微重复，通过核型嵌合比例结合CNV-seq 结果，可推测该患儿marker染色体为2 倍的22q11.1q11.21 片段重合组成，该片段包含TUBA8、PEX26、USP18 等16 个蛋白编码基因或基因片段，其中6 个OMIM morbid 基因，该重复片段与猫眼综合征有关，该综合征临床表型多种多样，如双眼虹膜下方垂直性缺损、白内障、脉络膜缺损、视网膜发育不全、类似猫眼、双眼距离增宽、睑裂小而斜、小眼球、斜视、轻度智力低下、心脏缺陷、肛门闭锁等，确定为致病性CNVs。虽然核型分析较CNV-seq 在大片段结构变异中更为直观，但CNV-seq 较核型分析断裂位点定位更为精确，两者在胎儿CHD 患者病因诊断中相互结合，能够有效提高CHD 的确诊率，明确染色体异常类型和断裂位点，为临床做出进一步诊疗提供依据。

本研究有4 例CHD 胎儿存在22q11.2 微缺失，22q11.2 微缺失综合征被认为是与CHD 最相关的微缺失/微重复综合征。它的表型变异谱比较宽，携带相同异常片段的个体表型不尽相同，可以从正常到生长发育迟缓、智力障碍、自闭症、先天性心脏病、唇腭裂、小头畸形、肌张力减弱等，片段缺失大小与表型之间不存在正相关，其外显率约21.9%[8-11]。Thomas 等[12]报道，22q11.2 微缺失综合征在胎儿CHD核型结果正常者中占6.4%。王瑾等[13]报道64%的22q11.2 微缺失综合征患者有CHD 表型，以圆锥动脉干畸形最为多见。这4 例CHD 胎儿心脏表型主要为永存动脉干、房室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、法洛氏四联症，心外表现为唇腭裂、单脐动脉、脉络丛囊肿和胎儿发育迟缓。它们父母表型正常，经CNV-seq 检测均为正常，证实胎儿为新发突变。除微缺失综合征以外，本研究经CNV-seq 检测发现1例22q11.2 微重复综合征，表型为三尖瓣狭窄，伴有心外异常（脉络丛囊肿）。由此可见22q11.2 微缺失/微重复是胎儿CHD 的另一主要病因。

综上所述，两种方法在检测CHD 胎儿染色体异常中各有利弊，联合应用可提高染色体异常检出率，从而明确胎儿CHD 的病因，为后续的遗传咨询提供可靠的病因学依据，指导患儿家庭做出最优选择。