茵陈五苓散对湿重于热型阻塞性黄疸胆道术后T 细胞亚群的影响

2024-01-10韩树旺尚海涛张德林郝成飞刘军舰

天津医科大学学报 2024年1期

韩树旺,尚海涛,张德林,郝成飞,刘军舰

（天津市中西医结合医院肝胆胰外科，天津 300100）

阻塞性黄疸（obstructive jaundice，OJ）也称为外科黄疸，是常见的外科疾病[1-2]。由于胆管的机械性梗阻引起胆汁流入肠道障碍，造成胆汁淤积，导致胆道内压力增高，胆汁通过肝细胞和毛细胆管逆行入血，从而可导致血中胆红素水平升高引起皮肤黏膜及巩膜黄染等一系列临床综合症状，且围手术期有较高的并发症发生率及病死率[3-5]。研究表明，OJ发生期间由于胆道梗阻可导致胆汁淤积、机体免疫功能紊乱等一系列病理生理变化[6]。有关报道指出胆总管结石是OJ 最常见的良性原因[7]。OJ 免疫功能受损是大部分并发症的原因，缘于肠肝轴和全身内毒素血症的动态平衡紊乱[8]。而OJ 引起的机体免疫功能变化主要表现为细胞免疫，高胆红素血症、高胆汁酸血症、内毒素血症等改变是机体OJ 时细胞免疫功能受损的原因。细胞ATP 酶、蛋白激酶，线粒体功能可被胆红素抑制，同时胆红素可改变细胞膜的通透性，淋巴细胞膜的结构和功能可以被高浓度的胆汁酸或胆盐直接损害[9-10]。及时解除病因使胆道再通是治疗本病的关键所在，探索有效且安全可靠的联合治疗方式显得格外重要。大量研究表明祖国医学对黄疸的治疗在利胆减黄保肝、改善机体细胞免疫功能方面有独特的优势[11-13]。本研究通过随机对照试验探讨清热利湿方——茵陈五苓散对因胆总管结石所致OJ 患者胆道术后细胞免疫功能的影响。

1 对象和方法

1.1 研究对象选取2021 年6 月至2022 年3 月天津市中西医结合医院肝胆胰外科收治的结石性阻塞性黄疸患者76 例，随机分为观察组（加用茵陈五苓散颗粒剂）与对照组各38 例，观察期间观察组1 例因个人原因而脱出，最终观察组共完成研究37例，对照组38 例。观察组平均年龄59（50，64）岁，男性14 例，女性23 例，美国麻醉医师分级（ASA）Ⅰ级19 例、Ⅱ级18 例；对照组年龄54（44.25，62.25）岁，男性13 例，女性25 例，ASA 分级Ⅰ级24 例、Ⅱ级14 例。所纳入患者均因胆总管结石造成的梗阻且术前有黄疸症状，参考张仲景《金匮要略黄疸病篇并治第十五》《中医内科学》（人民卫生出版社第2版）湿重于热型黄疸常见症状制定中医辨证标准：主症：（1）身目发黄如橘。（2）嗜卧乏力，头重身困。（3）无发热或身热不扬。次症：（1）右胁疼痛，脘闷腹胀。（2）纳呆便溏，厌食油腻。（3）恶心、呕吐。（4）口黏不渴，小便不利。（5）舌苔厚腻微黄，脉弦滑或濡缓。证型诊断评判标准为主症（≥2 项）加次症（≥2项），同时结合舌脉象。所有患者行胆总管探查取石术或内镜取石术解除梗阻。本研究通过了天津市中西医结合医院伦理委员会审批（批件号：NKYY_YXKT_IRB_2019_004_01），所有受试者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 纳入和排除标准纳入标准：（1）术前确诊为胆总管结石造成的OJ 患者。（2）胆道术后患者。（3）中医证型诊断为湿重于热证者。（4）年龄在18～75 岁，有独立行为能力者。（5）同意配合治疗者。排除标准：（1）肝细胞性黄疸患者。（2）肝自身免疫性疾病患者。（3）伴有严重心、肝、肾等重要脏器疾病，不耐受麻醉、手术患者。（4）服用过肝脏毒性药物的患者。（5）恶性梗阻性黄疸患者。

1.2.2 治疗方法对照组：西医常规治疗：（1）术后禁食。（2）术后给予抗感染。（3）术后纠正水、电解质和酸碱平衡及营养支持等。（4）术后止痛：根据患者情况可给予盐酸布桂嗪、氯诺西康、哌替啶等止痛药物。（5）术后合并症处理：对合并有其他基础病，如糖尿病、冠心病、高血压等，可采取相应的西医治疗措施。（6）为避免试验干扰，不加用其他如穴位敷贴、针灸、红外线照射等中医治疗措施。

观察组：在西医常规治疗的基础上，术后第1天开始加用茵陈五苓散（颗粒剂）（颗粒剂由天津市南开医院颗粒药房制备）。方药：方剂为茵陈五苓散（颗粒剂）（此方出处《金匮要略黄疸病并治第十五》）：茵陈30 g、泽泻25 g、猪苓15 g、茯苓15 g、白术15 g、桂枝10 g。服用方法：1 袋/次，2 次/d，早晚200 mL 温开水冲服或胃管注入。

1.2.3 标本收集及检测收集患者术前1 d、术后5 d、术后7 d 清晨空腹状态下外周静脉血，于精准医学科检验室检测CD3+T 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、CD4+CD25+Treg 细胞水平，剩余血液样本给予3 000 r/min 离心10 min 将血清和红细胞分离，血浆至于ETDA 抗凝管内予以3 000 r/min 离心30 min 取上清，按检测白细胞介素（IL）-10、转化生长因子（TGF）-β1一次用量分装，冻存于-20℃，待统一用ELISA 试剂盒检测。

1.2.4 试剂、仪器鼠抗人抗体CD3-perCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-APC（BD 公司，美国）；IL-10 ELISA 试剂盒（巧伊生物，安徽巧伊生物科技有限公司，中国）；TGF-β1ELISA 试剂盒（proteintech 公司，美国）；日本久保田KUBOTA 血液离心机（型号：KA-220，上海创萌生物科技有限公司，中国）；流式细胞仪（型号：FACSCalibur，Beckman Coulter公司，美国）；MR-96A 全自动酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，中国）。

1.2.5 流式细胞术检测 T 淋巴细胞亚群水平：（1）检测CD4+CD25+Treg 细胞：取EDTA-K2 抗凝血40 μL，加入CD4-FITC 和CD25-APC 荧光抗体5 μL，同型对照管另取40 μL 血加入IgG1-FITC、IgG2a-APC 荧光抗体5 μL，混匀，室温避光孵育20 min，加入2 mL 溶血剂，加PBS 缓冲液2 mL 重悬细胞，1 800 r/min 离心5 min，弃上清，再加PBS 缓冲液2 μL，上流式细胞仪检测并计数，以“CD4+CD25+”双阳性细胞表示CD25+T 淋巴细胞。（2）另取ETDA-K2抗凝血40 μL，加入CD4-FITC/CD8-PE/CD3-perCP荧光抗体5 μL，同型对照管另取40 μL 血加入IgG1-FITC/IgG1-pE/IgG1-perCP 抗体5 μL，其他条件同CD4+CD25+Treg 细胞，流式细胞仪检测并计数，以“CD3+”阳性表示CD3+T 淋巴细胞；“CD3+CD4+”及“CD3+CD8+”均为双阳性细胞分别表示CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞。

1.2.6 ELISA 检测血清IL-10、TGF-β1浓度（1）取出已经平衡室温的试剂、酶标板。（2）加样，分别设零孔、标准孔、待测样品孔，零孔加样样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL。（3）酶标板加上盖或覆膜，湿盒放置，37℃孵育120 min。（4）洗涤：用洗涤液洗涤板条4 次，每孔350～400 μL，使用毛巾或者滤纸将板内残留液体拍出，最后一次洗涤后确保板内无残留液体，避免毛巾或滤纸纤维进入板内。（5）每孔加100 μL 检测抗体，盖上封板膜，湿盒放置，37℃孵育60 min。重复步骤4。（6）每孔加100 μL HRP 标记抗体，盖上封板膜，湿盒放置，37℃孵育40 min。重复步骤4。（7）显色：每孔加TMB 显色液100 μL，37℃（不需要置于湿盒环境）避光显色15～20 min。（8）终止：每孔加终止液100 μL，加样后5 min 读数。（9）在Excel 工作表中以OD 值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准品曲线，对照未知样本中OD 值，按照曲线方程即可计算出标本中IL-10、TGF-β1浓度。

1.3 统计学处理采用SPSS 26.0 统计软件进行统计分析。所有计量资料经正态性检验后符合正态分布，均以表示，组间采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验；非正态分布计量资料以中位数和四分位数间距[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验，计数资料以例数、构成比（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料及脱失情况比较两组性别、年龄、是否合并高血压、糖尿病、冠心病、是否合并腹部手术史、ASA 分级等一般资料比较差异均无统计学意义（均P>0.05），见表1。

表1 两组患者一般资料比较[（n）%，M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of general data between the two groups of patients[（n）%，M（P25，P75）]

2.2 两组患者治疗前后CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴细胞、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+Treg 细胞变化两组患者治疗5 d、7 d，CD3+、CD4+T 淋巴细胞、CD4+/CD8+比值均较术前1 d 增加，CD4+CD25+Treg 细胞较术前1 d 减少，差异均有统计学意义（均P<0.05）；与对照组相比，术后5 d、7 d CD3+、CD4+T 淋巴细胞、CD4+/CD8+比值升高，CD4+CD25+Treg 细胞减少，差异均有统计学意义（均P<0.05），两组组内、组间CD8+T 淋巴细胞比较均无统计学差异（均P>0.05），见表2～6。

表2 两组治疗前后血清CD3+T 淋巴细胞的变化（，%）Tab.2 Changes of serum CD3+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

注：与术前1 d 相比，aP<0.05

表3 两组治疗前后血清CD4+T 淋巴细胞的变化（，%）Tab.3 Changes of serum CD4+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

注：与术前1 d 相比，aP<0.05

表4 两组治疗前后血清CD8+T 淋巴细胞的变化（，%）Tab.4 Changes of serum CD8+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

注：与术前1 d 相比，aP<0.05

表5 两组治疗前后CD4+/CD8+的变化（）Tab.5 Changes of CD4+/CD8+before and after treatment in two groups（）

注：与术前1 d 相比，aP<0.05

表6 两组治疗前后血清CD4+CD25+Treg 细胞的变化（，%）Tab.6 Changes of serum CD4+CD25+Treg cells before and after treatment in two groups（，%）

注：与术前1 d 相比，aP<0.05

2.4 两组患者治疗前后IL-10、TGF-β1变化术后5 d、7 d，与对照组比较，IL-10、TGF-β1降低较明显，差异有统计学意义（均P<0.05）；与术前1 d 比较，两组术后5 d、7 d，IL-10、TGF-β1降低，差异有统计学意义（均P<0.05），见表7、8。

表7 两组治疗前后TGF-β1 浓度变化（，pg/mL）Tab.7 Changes of TGF-β1 concentration before and after treatment in two groups（，pg/mL）

注：与术前1 d 相比，aP<0.05；TGF：转化生长因子

表8 两组治疗前后IL-10 变化（，pg/mL）Tab.8 Changes of IL-10 before and after treatment in two groups（，pg/mL）

注：与术前1 d 相比，aP<0.05；与对照组术后5 d、7 d 相比，bP<0.05；IL：白细胞介素

3 讨论

OJ 是常见的外科疾病，是多因素共同作用的结果，其中最常见的良性原因是由胆总管结石引起[7，14]。胆道梗阻可引起高胆红素血症、内毒素血症的发生，导致围手术期并发症发病率增加、免疫功能受损、全身多器官功能损害、营养障碍等。既往研究发现茵陈五苓散对OJ 机体细胞免疫功能具有改善作用，增强机体抗感染能力。茵陈五苓散最早出自张仲景的《金匮要略·黄疸病》，其属于经典方剂，在清热利湿、利胆退黄方面一直备受推崇。其中君药茵陈，具有清热利湿功效；泽泻、茯苓、猪苓具有利水渗湿的功效；白术具有健脾燥湿的功效；桂枝具有通阳化气行水的功效，诸药相配伍共凑清热利湿、利胆退黄功效。现代药理研究发现，茵陈五苓散的化学成分主要是香豆素、多糖类、萜类及挥发油，具有抗脂质过氧化以及减黄保肝的功效，同时对化学物质导致的肝损伤具有保护作用，可促进肝再生，调节细胞免疫[15-17]。

OJ 患者因胆汁淤积、高胆红素血症等因素对机体免疫功能产生了影响，尤其细胞免疫功能被抑制。本研究观察结果发现，OJ 患者通过手术有效解除梗阻之后可以改善免疫功能，观察组联合茵陈五苓散可以加快机体细胞免疫功能恢复。在本研究中两组患者在胆道术后治疗5、7 d，CD3+T 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、CD4+/CD8+比值均较术前1 d 增加，CD4+CD25+Treg 细胞较术前1 d 减少；术后5、7 d观察组和对照组组间比较显示，CD3+、CD4+T 淋巴细胞、CD4+/CD8+比值变化差异有统计学意义，说明联合茵陈五苓散治疗可加快改善细胞免疫功能，且治疗时间越长对改善细胞免疫功能的作用越明显。CD8+在观察组及对照组组内、组间各时间段比较差异均无统计学意义，提示CD8+T 淋巴细胞在OJ 病理过程中数量无明显变化。而CD4+/CD8+术前术后变化显著，说明CD4+/CD8+越高，T 细胞免疫应答能力越强，提示对照组患者术后细胞免疫功能恢复慢于观察组。这与先前的研究相一致[12，18-19]。

TGF-β1、IL-10 是由Treg 细胞分泌的抑制性细胞因子，通过细胞因子发挥免疫抑制功能。研究发现通过某种手段降低OJ 患者Treg 细胞的表达进而减少TGF-β、IL-10 的表达，Treg 细胞在其体内所介导的免疫抑制效应将可能降低甚至逆转，从而在提高OJ 患者免疫功能，降低并发症发生率、提高治疗效果和改善预后方面发挥积极作用[20-21]。既往研究证实中医药可以改善OJ 患者机体免疫细胞功能，主要表现为Treg 细胞数量减少，本研究结果显示，细胞因子TGF-β1、IL-10 随Treg 细胞变化而变化，说明茵陈五苓散在细胞免疫恢复方面起到了积极的辅助作用，且对照组慢于观察组。

综上所述，本研究通过临床随机对照观察发现，利用外科手术可有效解决胆道梗阻问题，术后联合茵陈五苓散能在保证安全的前提下，加快利胆减黄，恢复机体细胞免疫，中西医凭借各自的优势，相互补充，加快患者术后恢复。中医药可以作为OJ围手术期的重要辅助措施，并且安全可靠，值得临床推广。