解毒活血汤对慢性肾脏病大鼠肾脏FGF23、Klotho表达的影响

周 鹏,孙妲男,李 勇,徐 丽,乔 伟

(1.黑龙江中医药大学研究生院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院肾内科,黑龙江 哈尔滨 150001)

慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)发病率近年来逐年升高,有研究结果证明,其在全球一般人群中的患病率已经高达14.3%[1]。钙磷代谢紊乱是CKD患者常见的临床表现,它会导致矿物质和骨代谢的异常,引发肾性骨病、多系统功能损伤、心血管意外事件高发等[2]。目前临床治疗CKD钙磷代谢紊乱采用的主要治疗方法为调节血磷与血钙,治疗继发性甲状旁腺功能亢进症[3]。成纤维细胞生长因子23(Fibroblast growth factor,FGF23)是由来自于长骨中的成骨细胞与骨细胞合成和分泌的,其可作用于肾脏,参与调节机体血磷,使其维持动态平衡[4]。Klotho具有预防血管钙化(Vascular calcification,VC)的作用,能够抑制磷的吸收,加速尿磷的排泄进而减轻机体磷负荷[5]。本研究基于《内经》“去菀陈莝”理论及慢性肾衰“脾肾亏虚、湿浊瘀血阻脉”病机,有其理论依据;临床实践也证实解毒活血汤对CKD患者临床疗效较好,可显著改善肾功能和钙磷平衡[6],但关于解毒活血汤是如何影响CKD所致钙磷代谢紊乱的研究仍较少。综上,本次实验探讨解毒活血汤对慢性肾脏病大鼠肾功与肾脏FGF23、Klotho蛋白表达的影响以及其对Ca、P的影响,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 NW10LVF型超纯水系统购于香港Heal Force公司;DW HL-668型-70 ℃超低温冰箱购于安徽中科美菱公司;UV752N型紫外可见分光光度计购于上海佑科公司;Synergy H1型多功能酶标仪购于美国 BioTek公司;HH-4型数显恒温水浴锅购于金坛荣华仪器公司;DYY-7C型电泳仪、DYCZ-24DN型双垂直蛋白电泳仪购于北京六一公司;DH36001B型电热恒温培养箱购于天津泰斯特公司;H-2050R型超速冷冻离心机购于湖南湘仪公司;ELX-800型酶标仪购于美国 BIOTEK公司;磷测试盒(C006)、肌酐(Cr)测定试剂盒(C011)、钙测试盒(C004)购于南京建成公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒(WLA004)、尿素氮(BUN)测试盒(WLA120)、全蛋白提取试剂盒(WLA019)、SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒(WLA013)、Western洗涤液(WLA025)SDS-PAGE电泳液(干粉)(WLA026)、ECL发光液(WLA003)购于万类生物公司;FGF-23 antibody(DF3596)、Klotho antibody(DF10309)购于中国 affinity公司。

1.2 实验动物与模型制作 无特定病原体级(SPF)级健康雄性SD大鼠60只,6～8周龄,体重(210±10)g,购于黑龙江中医药大学药物安全性评价中心[实验动物生产许可证号：SCXK(黑)2018-003],饲养于黑龙江中医药大学药物安全性评价中心[许可证号：SYXK(黑)2016004]。所有大鼠均饲养于无特定病原体级的动物房,光亮12 h光,12 h暗交替,温度(23±3)℃,湿度45%～55%,自由饮食,饮水。随机分为空白组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组,每组各12只。实验均按照国际实验动物使用和关怀指南对大鼠的进行处置。

造模方法：空白组不予处理,其余各组第1周至第4周,腺嘌呤250 mg/kg剂量每日灌胃1次,持续4周;第5周至第8周,同样剂量的腺嘌呤隔日灌胃1次;第1周至第8周,模型鼠全部采用高磷饮食,含磷量为1.2%。第5周至第8周,中药组用解毒活血汤灌胃治疗,大鼠中药给药剂量按照人-大鼠体表面积换算(1∶6.25),并以临床成人用药剂量的1、2、4倍给药,分为中药低[1.4 g/(kg·d)]、中[2.8 g/(kg·d)]、高[5.6 g/(kg·d)]剂量组。空白组灌胃等量0.9%氯化钠溶液,连续给药8周。每7 d记录1次大鼠体重,服药量按体重的变化调整,每天上午定时灌胃给药。

1.3 实验药物 解毒活血汤：丹参、葛根各20 g,红花、连翘、当归、桃仁、枳壳、生地、柴胡、赤芍、甘草各15 g。中药饮片均购于黑龙江中医药大学附属第二医院饮片药局,草药用10倍蒸馏水浸泡0.5 h后,加蒸馏水煎煮2次,合并2次滤液,过滤浓缩至生药含量2.8 g/ml,浓缩置于4 ℃冰箱备用。

1.4 标本采集方法 血液指标测定各组动物眼眶取血分离血清,大鼠处死前一天测体重并禁食,眼眶取血1 ml,离心留取血清,-20 ℃冻存(测定血清肌酐、尿素氮、钙、磷)。

1.5 理化指标测定 各组大鼠分别于4、6、8周末取血,采用全自动生化分析仪检测血钙、磷、尿素氮、肌酐血液标本,按试剂盒说明操作。

1.6 Western blot检测大鼠肾脏FGF23、Klotho蛋白表达 取大鼠肾脏加入裂解液,制成组织匀浆,4 ℃低温条件下进行12000 r/min离心10 min,取上清定量蛋白。每组取40 μg蛋白,与上样缓冲液混匀并沸水浴5 min,进行SDS凝胶电泳。结束后取凝胶,进行PVDF转膜,4 ℃条件下浸于5%脱脂奶粉摇床缓慢摇动1 h,4 ℃条件下一抗溶液(FGF23,Klotho)孵育过夜,洗膜,室温下二抗溶液(羊抗兔IgG)孵育45 min,洗膜,曝光,以β-actin为内参,将胶片进行扫描,用凝胶图像处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清肌酐、尿素氮、钙、磷水平比较 研究结果显示,与空白组比较,模型组血清肌酐、尿素氮、磷均显著增高(P<0.05),血钙降低(P>0.05);中药高剂量组血清肌酐、尿素氮、血钙显著增高(P<0.05),血磷升高(P>0.05);中药中剂量组、中药低剂量组血清肌酐、尿素氮、磷显著升高(P<0.05或P<0.01),血钙升高(P>0.05)。与模型组比较,中药高剂量组血清肌酐、尿素氮、钙、磷均显著改善(P<0.05);中药中剂量组血清肌酐、尿素氮、磷下降(P>0.05),血钙增加(P<0.05);中药低剂量组血清肌酐、尿素氮、钙、磷下降(P>0.05)。与中药低剂量组比较,中药高剂量组血清肌酐、尿素氮显著下降(P<0.05),血钙上升(P>0.05),血磷下降(P>0.05);中药中剂量组均有改善(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清肌酐、尿素氮、钙、磷水平比较

2.2 各组大鼠肾脏FGF23、Klotho蛋白表达的比较 研究结果显示,与空白组相比,模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组FGF23、Klotho蛋白相对表达量均显著下降;与模型组相比,中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组FGF23、Klotho蛋白均有显著改善。见表2、3、图1、2。

A：空白组;B：模型组;C：中药高剂量组;D：中药中剂量组;E：中药低剂量组

A：空白组;B：模型组;C：中药高剂量组;D：中药中剂量组;E：中药低剂量组

表2 各组大鼠FGF23表达量

表3 各组大鼠Klotho蛋白表达量

3 讨 论

中医学古代文献中没有“慢性肾衰竭”的专属病名,但与其相近的描述散见于“水肿”“癃闭”“肾风”“关格”“溺毒”“虚劳”等病症中。如《证治汇补》中提出：“既关且格,必小便不通。”慢性肾衰竭具有较为复杂的病因病机,大多都由多病邪、多个脏腑同时致病,且以虚邪为主,夹以实邪,虚实夹杂,使病情迁延难愈,反复发作[7],临床常见证型有肝肾阴虚、脾肾阳虚、湿毒内停等,但病因病机主要以肾虚、血瘀和湿毒为主。肾阴亏虚日久,阴损及阳而致阳虚,阳不化阴,使分泌清浊功能减退,导致湿浊潴留;肝阴虚使肝失于阴精濡养而致肝气疏泄失常,气机不利,更使湿浊之邪难以疏泄;肾阳亏虚无力温煦脾土,则脾阳亦伤,脾阳虚运化失健,则瘀血内生,湿浊内停。肝、脾、肾三脏俱虚,气机疏泄失常而致水湿、浊毒、瘀血停滞体内,三者又互相为病日久终致关格不通[8]。

《黄帝内经》提出水肿的治疗原则 “平治于权衡,去菀陈莝,……开鬼门,洁净府”,即以活血化瘀之法祛除瘀滞的痰浊瘀血,再加以补气固本类药物的推动,使邪气从汗孔及膀胱排出。后世张仲景继承发扬此理论,于《伤寒杂病论》中创造性地提出具体疗法和方药,近现代的医家以此为理论基础,结合各自临床经验,提出了活血通络、清利湿热、补气养阴等方法,临床应用皆取得了不错的疗效[9-10]。《金匮要略》中提出：“趺阳脉伏,水谷不化,脾气衰则鹜溏,胃气衰则身肿……经为血,血不利则为水,名曰血分。”《血证论》也提出：“血与水本不相离。”[11]由此可知,脾胃阳气亏虚,运化水谷无力,气血生化乏源,导致气虚推动血行无力,产生瘀血,瘀血阻滞水道,水道不通,水失其道,同时脾胃五行属土,土虚水侮,泛溢肌肤,导致水肿,离道之水阻滞经络,经络不通,又会导致瘀血的形成,加重水肿,故曰血瘀可导致水气停聚化为湿浊,湿浊亦可导致血瘀,瘀血与湿浊相互影响,互为病理产物[12]。“去菀陈莝”是中医活血化瘀治水法的来源,当取“活血化瘀,利湿化浊”之义。“久病必治络[13]”,注重并活用活血化瘀之法,在CKD患者的治疗当中,尤其是久病患者,往往可以提高临床疗效,减轻患者痛苦。

解毒活血汤在古籍中记载为用于热毒血瘀之证的治疗[14]。连翘清热解毒,柴胡、葛根可升提阳气以助正气,也可助连翘发挥其效,当归、生地活血滋阴,赤芍、桃仁、红花可活血化瘀,枳壳理气行气,甘草可调和诸药。现代药理学研究表明,连翘可以抗氧化、缓解疲劳、降脂、抗炎、抗菌[15],柴胡具有抗癌、镇痛、抗炎以及保护肾脏和降脂的作用[16],葛根能够抗炎、抗氧化、减轻细胞的损伤[17],当归、生地具有抗炎、保护肝脏与肾脏功能的作用[18],赤芍防止血栓、减少炎症因子产生[19],桃仁抗炎、促进血液循环、改善血管壁的弹性、保护肝肾[20],枳壳降低血脂、抗肿瘤、抗炎、保肝[21],甘草可以保护肝肾、抗炎和抗过敏[22],红花药理作用具有多样性,可以调节免疫功能[23]。该方以“去菀陈莝”理论为指导,全方起到清热解毒、凉血活血化瘀的作用,对CKD患者疗效甚好。

FGF23-Klotho轴通路与CKD患者钙磷平衡关系密切,与CKD后期导致的众多并发症有着紧密的联系,这也使得Klotho-FGF23轴有成为CKD防治的新靶点的可能性[24]。FGF23是成纤维细胞生长因子系列中的一种,可参与血磷的调节,CKD早期即开始升高,相关实验研究结果表明敲除小鼠FGF23基因会导致其发生钙磷代谢紊乱。另有研究表明,FGF23的过表达会抑制磷在肾小管的重吸收和钙、磷在肠道的重吸收过程,导致尿磷增加与甲状旁腺功能亢进,导致低磷血症、骨软化等病症的发生[25]。临床研究发现,Klotho蛋白具有调节高表达磷水平的能力,这种能力是通过降低肠道细胞与近端小管中相关蛋白的合成量发挥作用的,增加尿磷的排泄,使机体血磷浓度下降[26]。但随着病情的不断发展,残余的肾单位不断减少,使磷排泄障碍,最终导致高磷血症发生。 Klotho蛋白也可通过抑制相关的转运蛋白的表达来调控血磷的浓度,如NaPi2a;但其在机体中的高表达以及分泌的减少都会降低FGF23对血磷的调控能力。膜型α-Klotho蛋白可以和成纤维生长因子受体结合,形成FGF23的跨膜协同受体,增强FGF23-Klotho轴的功能,从而调节钙磷,但随着CKD的进展,FGF23表达持续升高,Klotho蛋白表达持续下降,使跨膜协同受体减少无法满足FGF23的结合需要,产生FGF23抵抗,所以可通过调节失衡的FGF23-Klotho轴以达到改善机体高磷低钙的状态。

在本次实验中我们可以发现,和模型组相比,CKD大鼠肾功水平的改善与解毒活血汤浓度呈正相关,解毒活血汤的浓度越高,对降低CKD大鼠血清肌酐和尿素氮的效果越好;解毒活血汤的浓度越高,FGF23与Klotho蛋白在肾脏组织的表达量越高,进而使失衡的FGF23-Klotho轴趋向平衡,调节CKD大鼠的钙磷代谢,使血钙上升,血磷下降。

解毒活血汤可以改善CKD 大鼠肾脏功能,其可以通过提高CKD大鼠肾脏组织中FGF23、Klotho蛋白的表达影响失衡的FGF23-Klotho轴,进而调节CKD大鼠血中钙、磷浓度,且对其作用效果与解毒活血汤剂量相关,但解毒活血汤如何影响Klotho、FGF23蛋白表达的机制的研究仍然不清,所以还需要大量的临床研究与实验研究来明确Klotho、FGF23蛋白对肾脏功能的调节机制,证实FGF23-Klotho轴作为CKD治疗靶点的效果及安全性。