蓝刺头对去卵巢大鼠血清P1NP、β-CTX及TNF-α、IL-1β、IL-6的影响

方 婷, 董重阳,任存霞

(1.内蒙古医科大学中医学院,内蒙古 呼和浩特 010059;2.呼和浩特市中医蒙医医院,内蒙古 呼和浩特 010010)

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)常发病于女性绝经后5～10年内,以骨皮质变薄及骨密度减低为主要病理改变,以雌激素水平下降为主要病因,中晚期出现疼痛、骨折为主要症状的代谢性骨病[1]。本病严重地影响老年人的身体健康和生活质量。传统医学中的很多药物都是来自于天然,如果能从这些传统民族药物中发现能够防治PMOP的药材,对其不断研究,相信PMOP给患者带来的痛苦一定会得到减轻,且防治同时不会引起机体其他病变。诸多文献表明蒙药亦能够有效的提高PMOP患者的骨密度、改善全身疼痛等症状,且具备资源丰富、疗效显著、不良反应少等优势,治疗 PMOP方面值得推广。蒙药蓝刺头(Echinops latifolius)首次记载于蒙医医典《智慧文鉴》中,其药性凉,味苦,功效为接骨、愈伤、固骨质、清热和止痛。临床中常用于骨伤热、筋骨折伤、金创及疼痛等病症的治疗[2]。近年来研究发现其在防治PMOP方面疗效确切,且靶点丰富,机制清楚。骨代谢标志物Ⅰ型前胶原N端前肽(P1NP)和Ⅰ型胶原羧基端肽 β 特殊序列 (β-CTX)是监测骨转换的重要指标,具有特异性强、灵敏度高的特点,近年来应用日趋广泛。炎症反应已被证实可以导致过度的骨吸收进而破坏骨平衡[3]。基于以往研究,本文研究了蒙药蓝刺头对去卵巢大鼠血清骨代谢标志物P1NP和β-CTX以及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影响,主要目的为阐明其抗骨质疏松作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器：本研究所用主要仪器包括台式离心机(TGL-16c上海安亭科学仪器厂),酶标分析仪(AMR-100 杭州奥盛仪器有限公司),正置显微镜(NIKON ECLIPSE CI日本尼康公司)等。

1.1.2 主要药品与试剂：蒙药蓝刺头煎汤按 4∶2∶1 的比例制备为高、中、低剂量组;淫羊藿(Herb epimedii)颗粒,由广东一方制药有限公司生产,产品批号：A2025881。大鼠P1NP ELISA试剂盒(MM-20710R1酶免生物),大鼠β-CTX ELISA试剂盒(MM-20172R1酶免生物),大鼠TNF-α试剂盒(MM-0180R1酶免生物),大鼠IL-6试剂盒(MM-0190R1酶免生物),大鼠IL-1β试剂盒(MM-0047R1酶免生物)等。

1.1.3 实验动物：4月龄清洁级健康雌性SD系未孕大鼠72只,重量为(250±20)g,购买于内蒙古医科大学实验动物中心,实验动物生产许可证号为SYXK(蒙)2020-0003。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、造模与给药：将72只大鼠常规饲养7 d后按照随机数字表法分为假手术组、模型组、蓝刺头高剂量组、蓝刺头中剂量组、蓝刺头低剂量组、淫羊藿组,共六组,每组12只。选取大鼠卵巢摘除法(去势)制备绝经后骨质疏松症大鼠模型[4]。异氟烷吸入麻醉后,开腹找到卵巢,进行切除、结扎止血,最后将腹腔内容物复位,逐层缝合,消毒处理。假手术组只切除卵巢周围少量脂肪组织。参照人鼠体重比例及人鼠代谢比率计算：蓝刺头高中低剂量组分别为：13、6.5、3.25 mg/ml。其中蓝刺头低剂量组为临床等效剂量。淫羊藿组给药剂量为成人的有效剂量：23.4375 mg/ml。除外模型组和假手术组给予0.9%氯化钠溶液灌胃。其余组灌胃体积以大鼠体重每100 g/2 ml计算得出,每天1次,连续3个月。

1.2.2 大鼠造模成功的判定：观察阴道脱落细胞是用于判断啮齿动物的动情周期的一种可靠方法[5],实验大鼠在造模后4 d内行阴道涂片以判断造模是否成功。

1.2.3 大鼠股骨近端骨密度的检测：末次灌胃1 d后,各组大鼠予以腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉,采血取骨,应用Micro-CT检测大鼠处理后的右侧股骨近端骨密度(BMD)。

1.2.4 血清P1NP、β-CTX检测：用酶联免疫法(ELISA法)测定血清P1NP、β-CTX的含量。于腹主动脉采血约6 ml,4 ℃冰箱静置2 h后进行离心(3000 r/min),20 min后收集血清,按照试剂盒说明书操作。

1.2.5 血清TNF-α、IL-1β、IL-6检测：采用酶联免疫法(ELISA法)测定血清TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。于腹主动脉采血约6 ml,4 ℃冰箱静置2 h后进行离心(3000 r/min),20 min后收集血清,按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法 使用SPSS 25.0统计学软件进行统计分析。实验先进行正态性检验和方差齐性检验,符合正态分布和方差齐条件时两组间比较应用t检验,不符合正态分布和方差不齐时采用校正的t检验;α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 阴道脱落细胞观察 结果显示：大鼠正常的动情周期包括动情前期、动情期、动情后期、动情间期,持续4～5 d。本次研究中假手术组可见动情周期规律交替,持续4 d;模型组4 d之内未出现动情周期规律性变化,提示PMOP大鼠模型造模成功[6](图1)。

图1 大鼠阴道脱落细胞涂片(HE染色,×100)

2.2 各组大鼠BMD测定结果 与假手术组相比,模型组大鼠股骨近端的BMD明显下降(P<0.05);与模型组相比,蓝刺头高剂量组、蓝刺头中剂量组、蓝刺头低剂量组、淫羊藿组的BMD均有升高(P<0.05)。见图2、3、表1。

表1 各组大鼠股骨近端BMD(mg/cm3)

图2 假手术组股骨近端Micro-CT显示图

图3 模型组股骨近端Micro-CT显示图

2.3 各组大鼠血清P1NP和β-CTX测定结果 与假手术组相比,模型组的P1NP和β-CTX显著升高(P<0.01)。与模型组比较,蓝刺头高剂量组、蓝刺头中剂量组、蓝刺头低剂量组和淫羊藿组P1NP和β-CTX均下降(P<0.05),但以蓝刺头高剂量组下降最明显。说明蒙药蓝刺头对于P1NP和β-CTX的影响趋势为剂量依赖型。见表2。

表2 各组大鼠血清P1NP、β-CTX含量比较

2.4 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α测定结果 与假手术组相比,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度均明显升高(P<0.01)。与模型组相比,各组IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度均降低(P<0.05)。蓝刺头高剂量组与中剂量组比较无统计学差异(P>0.05)。蓝刺头低剂量组与淫羊藿组比较无统计学差异(P>0.05)。高、中剂量组蓝刺头降低PMOP模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β浓度的药效强于淫羊藿。见表3。

表3 各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度比较(ng/L)

3 讨 论

蒙医学在治疗PMOP方面有其独特的自身优势,具有疗效与安全兼备的特点,其发展前景广阔。传统蒙医学认为骨质疏松症(Osteoporosis,OP)的发病原因主要在于肾虚则骨濡养不及而出现骨枯,治疗原则宜以“补暖补精、抑赫依过剩、固骨质”为主。经过众多医家多年以来针对蒙药蓝刺头的临床运用探索,发现其对PMOP的防治不仅效果明显,而且安全、不良反应少,作用机制丰富独特,主要包括抗炎、抗氧化应激、增加骨量、减少骨丢失和雌激素样作用[7]。

骨代谢平衡是成骨细胞与破骨细胞之间的一种动态状态,当这种状态被破坏后就会致使骨重建及代谢失衡,诱发多种骨病[8]。P1NP及β-CTX是两种具有高度敏感性的骨代谢标志物[9],是衡量骨转换的敏感指标,可以反映骨代谢过程[10-11]。而BMD一般要在治疗6个月后才能用以评判疗效[12-13],因此在监测疗效方面,骨代谢标志物有着重要意义。可以通过检测血清中这些指标的变化来早期判断骨重塑的情况。P1NP 是由活化的成骨细胞释放,其在血清中的含量可以反映成骨细胞合成骨胶原的能力[14],是骨形成的敏感指标;而β-CTX 是在骨吸收过程中Ⅰ型胶原分解后释放入血的一种片段,可以用以判断破骨细胞的活性,是骨吸收的特异指标[15]。研究显示与非骨质疏松患者相比,骨质疏松患者的P1NP和β-CTX明显升高[16]。本实验结果显示：与假手术组相比,模型组大鼠P1NP和β-CTX均升高。这也与赵和平[17]研究结果一致：PMOP患者血清P1NP、β-CTX水平高于正常者。而经蒙药蓝刺头治疗90 d后,其各剂量组血清P1NP、β-CTX水平均有下降,且为剂量依赖型。表明蒙药蓝刺头可以抑制骨吸收,增加骨量,有助于维持骨代谢平衡,进而防治PMOP。

PMOP 发病涉及系统性炎症激活[18]。而炎症反应已被证实可以导致过度的骨吸收进而破坏骨平衡[19]。IL-6和TNF-α是强烈的骨吸收刺激因子,TNF-α在破骨细胞生成中起着正向作用,可以促进骨吸收,引起骨量减少[20]。IL-6 可直接作用于成骨细胞,抑制其活性,减少骨形成;也可以促进破骨细胞生成,加强骨吸收,加重骨量流失,诱发骨质疏松[21]。有学者指出,IL-6、TNF-α对骨吸收具有增益效应[22]。IL-1β也是PMOP的诱因之一,当绝经后体内雌激素水平下降时,一方面IL-1β降低骨保护素的表达,进而抑制骨形成;另一方面IL-1β 也可直接通过RANKL诱导破骨细胞的分化成熟,促进骨吸收。研究发现：经雌激素治疗后的PMOP患者体内IL-1水平低于未经治疗的PMOP患者[23]。在本实验中,研究结果显示：摘除卵巢后的大鼠模型体内的TNF-α、IL-6、IL-1β的含量高于假手术组,这正与袁显群[24]的实验结果吻合。而经过蒙药蓝刺头治疗后的大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β明显下降,并且低剂量的蒙药蓝刺头与淫羊藿在降低PMOP模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β的药效相当。高小明等[25]通过实验也证明蒙药蓝刺头可以降低去势模型大鼠的炎症因子含量。而本实验研究说明：蒙药蓝刺头各剂量组可以通过降低PMOP患者血清炎性因子的含量,进而减少骨吸收,促进骨形成,增加骨量,达到防治PMOP的作用。