仔猪源链球菌分离鉴定与耐药性试验

2024-01-10王晓艳

中国猪业 2023年6期

王晓艳

(山东省莒南县检验检测中心，山东临沂 276600）

链球菌（Streptococcus）是临床中常见的人畜共患病原菌之一，该菌广泛存在于自然界的土壤、水源及养殖环境中，且大多数的健康动物体内也存在该细菌[1]。链球菌可以感染多种家畜（猪、牛、羊、鹿）、家禽（鸡、鸭、鹅）甚至感染人，并引起畜禽发病，该菌可以引起多种动物和人的败血症、脑膜炎、关节炎、肺炎、乳房炎、腹泻、化脓及毒素引起的休克等一系列的临床症状，同时该菌可以引起人患病，严重危害着动物和人类健康，因此，临床上对该病的防控具有重要意义[2,3]。猪链球菌病是严重危害养猪业的细菌性疾病之一，该病是由不同血清型的链球菌引起的，对各个阶段的猪只均有感染，其中对仔猪危害较大，临床上多以急性症状中的脑膜炎、败血症、心内膜炎和慢性症状的关节炎为常见，其感染率和死亡率均较高，死亡率高达80%以上，且在临床中经常与病毒性疾病（猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2 型）混合感染，给全球养猪业带来严重的经济损失[4-7]。

近年来，对于猪链球菌病的报道越来越多，链球菌可以感染不同阶段的猪，其中对仔猪最易感，尤其4～10日龄仔猪，临床中以肺炎、化脓性感染、渗出性皮炎及脱水为主要症状，其死亡率较高[8,9]。国内外研究表明，链球菌有较强的耐药性，且已经普遍存在并呈现逐年增高的趋势，链球菌的耐药性给临床治疗该病带来一定困难，且其耐药性可以在动物和人之间相互传播，已成为公共卫生安全问题[10,11]。本试验对采集患病仔猪病料样品进行链球菌分离鉴定，并检测其致病性和耐药性，以期为山东莒南地区仔猪源链球菌的合理用药提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 菌株来源

2020-2021年采集山东莒南县部分养猪场病死仔猪的鼻拭子、肺脏和肝脏等组织病料127 份，采集的病料组织经处理后，进行链球菌的分离鉴定。

1.2 细菌分离与培养

将采集的样品进行处理后，无菌条件下接种于7%绵羊脱纤血培养基上，进行增菌培养，37℃恒温培养12～18 h 后，挑取单个菌落接种于链球菌培养基中进行鉴别培养（12～18 h），然后进行革兰氏染色镜检观察其形态学。

1.3 生化试验鉴定

参照Raid ID 32 STREP 阳性菌鉴定试剂盒说明书进行试验，将分离菌株接种在营养肉汤中培养至对数期，调整菌液浓度为0.5 个麦氏浊度，无菌条件下，接种于试纸条中，37℃培养12～18 h，然后进行生化特性鉴定。

1.4 细菌PCR 鉴定

设计细菌16S rRNA 基因通用引物，送上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物（表1）。用水煮法提取分离菌株的基因组并进行PCR 鉴定。回收PCR 产物，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，通过BLAST 搜索比对结果，以确定为链球菌菌株。

表1 引物序列

表2 药敏试验结果

1.5 致病性试验

将分离菌株接种于营养肉汤中，并培养至对数期，调整菌液浓度为107CFU/mL，每株分离菌株腹腔注射给2 只昆明系小鼠，剂量为0.25 mL/ 只（107CFU/mL），对照组小鼠腹腔注射等量的无菌生理盐水。试验期7 d，观察小鼠的发病情况。

1.6 药敏试验

分离菌株的药敏试验参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）2013年推荐的药敏试验法标准进行操作与结果判定。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

疑似链球菌的菌株通过7%绵羊脱纤血培养基、甘露醇氯化钠鉴别培养基分离培养及镜检观察其形态学结果，均符合链球菌的培养特性和形态学特征。

2.2 细菌生化试验

通过Raid ID 32 STREP 阳性菌鉴定试剂盒进行生化鉴定，68 株分离菌株初步鉴定为链球菌。

2.3 细菌PCR 鉴定

对初步鉴定为链球菌的菌落，用PCR 进行鉴定。结果显示分离的68 株分离菌株均扩增出大约为1 500 bp的目的条带（图1）。通过测序对比68 株分离菌株与参考株（链球菌）的同源性均大于98%，构建系统发育树（图2）说明分离株为链球菌，此试验链球菌的检出率为53.5%（68/127）。

图1 部分分离菌株PCR 鉴定结果

图2 分离菌株代表株（JM202010）系统发育树

2.4 致病性试验

攻毒组小鼠在攻毒2～3 d 后，出现了不同程度的发病，且个别攻毒小鼠不表现任何症状而出现急性死亡，剖检死亡小鼠后采集病料组织，分离得到链球菌，攻毒试验结束后，对照组小鼠仍健康存活。经统计，有50株链球菌能引起小鼠死亡，确定为致病性菌株。

2.5 药敏试验

分离菌株的耐药性分析显示，50 株致病性链球菌对新霉素、氟苯尼考、大观霉素、氨苄西林、庆大霉素、磺胺间甲氧嘧啶、青霉素、阿莫西林、氨苄西林、多西环素等9 种药物的耐药率为52.0%～84.0%，对头孢噻呋、头孢噻肟、恩诺沙星、环丙沙星、林可霉素5 种药物耐药率为4.0%～30%；说明临床中分离的50 株致病性链球菌对临床中常用的药物具有不同的耐药性。

3 讨论

链球菌是一种临床上常见的人畜共患的条件性致病菌，该菌广泛存在于动物和人类的体内及环境中，可以通过多种途径（直接接触传播、空气传播、创伤皮肤和黏膜、脐带等感染）在不同动物（鸡、猪）之间传播[10,11]。链球菌可以引起猪、牛、羊、鸡、鸭、兔等多种动物感染，急性病例具有发病比较急、死亡较迅速等特征，为临床中畜禽常见的急性、败血性疾病[12]。陈申申等[13]报道了从患有脑膜炎的仔猪体内分离得到致病较强的链球菌。王飞鸿等[14]从规模化养殖场死亡的仔猪中分离得到致病性较强的链球菌。猪链球菌病成为养猪业中常见的细菌性疾病之一，尤其对仔猪的危害较大。本试验采集山东莒南地区养猪场病死仔猪的鼻拭子、肺脏和肝脏等病料组织127 份，分离到50 株致病性链球菌，说明链球菌在该地区猪场中流行较严重，可能对仔猪存在潜在威胁，养猪场应注意猪链球菌的防控，同时注意环境卫生，加强饲养管理，提高仔猪的免疫力。

临床中猪链球菌病主要通过抗生素药物进行防治，随着抗生素的不合理使用或过量添加，猪场中的一些细菌对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类等药物产生了较强的耐药性，其耐药性菌株不断出现，同一地区不同养殖场的细菌，其耐药性也存在差异，降低了抗生素对猪病的治疗效果[7]。本研究表明，50 株致病链球菌对新霉素、氟苯尼考、大观霉素等9 种药物耐药率在52.0%以上，对其他的药物耐药率为4.0%～30%。说明从该地区养猪场中分离的链球菌对临床中常用的药物存在不同耐药性，且耐药严重。因此，在临床中治疗猪链球菌病应该进行药敏试验，选择敏感的药物进行交替使用，同时应该配合环境消毒，提高治疗效果。