氟苯尼考和硫酸粘菌素对猪源大肠杆菌、链球菌的体外抑菌试验

2024-01-10杨春利

中国猪业 2023年6期

杨春利

(鲁山县农业农村局，河南平顶山 467300）

大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是肠杆菌科肠杆菌属革兰氏阴性鞭毛状细菌，能引起猪的多种疾病，主要感染哺乳仔猪、断奶仔猪，是世界范围内导致哺乳仔猪和断奶仔猪死亡的重要致病菌[1]。猪大肠杆菌病根据临床表现不同分为仔猪白痢、仔猪黄痢和猪水肿病[2]。猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）是世界范围内影响养猪业生产的又一重要病原菌，它也被认为是一种新兴的人畜共患病原体，患病猪表现为关节炎、脑膜炎、心内膜炎、败血症及支气管肺炎等多种病理特征[3,4]。以上2 种细菌性传染病在我国各地区养猪场广泛分布，且存在混合感染病例，发病率和病死率较高，给养猪生产者造成严重的经济损失，且威胁公共卫生安全。抗生素药物防治是临床兽医实践中常用的防控大肠杆菌病和猪链球菌病的方法，氟苯尼考（florfenicol）是新一代动物专用的酰胺醇类广谱抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和支原体均有作用，对大肠杆菌、沙门氏菌、炭疽杆菌、肺炎链球菌、葡萄球菌及衣原体等多种病原体均有敏感性[5]。硫酸粘菌素（Colistin Sulfate）为多粘杆菌产生的由多种氨基酸和脂肪酸组成的碱性多肽类抗生素[6]，主要用于防治动物肠道细菌感染和促进动物的生长，对于大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌等革兰氏阴性菌有较强的抑制作用[7]。但是，我国养殖业长期使用或者滥用抗生素导致的细菌耐药谱增宽、耐药性增强、多重耐药情况越来越严重，使得抗生素治疗动物疫病的效果下降，给动物的疫病诊治带来困难。正确的抗生素联合用药可以降低药物副作用，减少细菌耐药性的发生，发挥协同或相加的药效，提高治疗效果[8]。为了提高抗生素药效、用药安全性及抗菌活性，降低猪大肠杆菌、链球菌带来的危害，本试验通过微量肉汤稀释法，观察了氟苯尼考和硫酸粘菌素联合用药对治疗猪大肠杆菌、链球菌的效果，以期为兽医临床科学用药提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验抗生素

试验用抗生素由河南华牧生物科技有限公司生产，分别为含量99.00%的氟苯尼考，批号：2206121；含量98.00%的硫酸粘菌素，批号：2207152。

1.2 试验菌种

猪大肠杆菌12 株，猪链球菌15 株，均采自河南省平顶山市鲁山县部分养猪场发病猪的病料，经过临床分离鉴定后备用。大肠埃希菌质控菌ATCC25922、链球菌质控菌CVCC3223 均购自中国兽医药品监察所。

1.3 培养基

MH 肉汤培养基、MH 琼脂平板、KF 链球菌琼脂、麦康凯培养基均为广东环凯微生物科技有限公司生产。

1.4 药物储备液的制备

称取氟苯尼考2.56 g，以丙酮-水溶解、定容至1 000mL，配成浓度为2 560 μg/mL 的氟苯尼考储备液，-20℃保存备用。称取硫酸粘菌素2.56 g，用去离子水溶解、定容至1 000mL，配制硫酸粘菌素储备液，最终浓度为2 560 μg/mL，于-20℃保存备用。

1.5 菌液的制备

将大肠杆菌菌液、链球菌菌液复苏后分别接种于麦康凯培养基、KF 链球菌琼脂培养基上，37℃培养24 h，挑取典型菌落分别接种于MH 肉汤培养基中，增菌培养24～36 h，再挑取菌液分别接种于MH 琼脂平板、含5%犊牛血清的MH 琼脂平板培养基上，37℃培养24 h，然后分别挑取菌落接种于MH 肉汤培养基中，大肠杆菌37℃培养8 h、链球菌37℃培养16 h，平板计数法进行菌落计数，最后用PBS 稀释菌液浓度至1×106CFU/mL。

1.6 单药最低抑菌浓度（MIC）测定

采用96（8×12）U 型孔板微量肉汤2 倍稀释法测定每种药物的MIC 值。每排的第1～10 孔加入肉汤50 μL，第1 孔加入50 μL 终浓度为2 560 μg/mL 的硫酸粘菌素储备液，2 倍比稀释，依次稀释至第10 孔。然后在第1～10 孔加入事先稀释好的1×106CFU/mL 的菌液50 μL，第11、12 孔分别设置为阳性（有菌无药）、阴性（无菌无药）对照组。每种抗生素对每个菌株做3 个重复。同时以链球菌质控菌CVCC3223 做质量控制，37℃培养24 h，观察每孔内培养液浑浊程度的变化。氟苯尼考的MIC 值测定参考上述操作方法进行。当质控菌MIC 在美国临床和实验室标准协会（CLSI）制定的药物敏感性范围内[9]，且阳性对照孔内培养液浑浊（细菌生长良好），阴性对照孔内培养液清亮（无细菌生长）时，无细菌生长孔中的最低浓度药物即为药物的MIC 值。细菌敏感性判断标准参考CLSI 判断。见表1。

表1 药物敏感性试验判定标准（μg/mL）

1.7 联合抑菌试验

随机取1.6 中完成单药抑菌试验的菌株6 株（大肠杆菌、链球菌各3 株），利用棋盘稀释法进行测定氟苯尼考、硫酸粘菌素联合用药效果。以每种药所对应大肠杆菌、链球菌MIC 值为药物稀释度，药物最高浓度为MIC 值的2 倍，依次2 倍比稀释药液最高浓度，分别为1、1/2、1/4、1/8、1/16，共设5 个稀释浓度。在96 孔细胞培养板上将2 种药物按照横排和竖排分别进行联合抑菌试验，每孔加入浓度为1×106CFU/mL 的菌液，37℃培养18～24 h。同时设阳性、阴性对照，观察孔内培养液变化。采用联合用药的抑菌指数（fractional inhibitory concentration,FIC），以判定联合用药的药效安全性。FIC＝（联合时A 药MIC÷单用时A 药MIC）＋（联合时B 药MIC÷单用时B 药MIC）。FIC≤0.5，为协同作用，0.5＜FIC≤1，为相加作用，1＜FIC≤2，为无关作用，FIC＞2 为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 2 种药物单用最低抑菌浓度测定结果

由表2 可知，氟苯尼考对大肠杆菌、链球菌的MIC值分别为2～＞128 μg/mL、0.125～1 μg/mL，有3 株大肠杆菌对氟苯尼考敏感，占25.0%（3/12），有2 株链球菌对氟苯尼考敏感，占16.7%（2/12）；硫酸粘菌素对大肠杆菌、链球菌的MIC 值分别为0.5 ～8 μg/mL、64～＞128 μg/mL，有2 株大肠杆菌对硫酸粘菌素敏感，占13.3%（2/15），有2 株链球菌对硫酸粘菌素敏感。

表2 单独用药最低抑菌浓度（MIC）测定结果与菌株数

2.2 2 种药物联合体外抑菌试验结果

分别挑取完成单独用药抑菌试验的大肠杆菌、链球菌各3 株进行联合用药对2 种细菌的敏感试验，由表3可知，联合用药对大肠杆菌、链球菌的FIC 值分别为0.5 μg/mL、0.75 μg/mL 或1.0 μg/mL，发生协同或者相加作用，均未出现拮抗、无关作用，表明联合用药比单独用药对防治2 种细菌性疾病的效果好。

表3 2 种药物联合体外抑菌试验结果

3 讨论

在当前猪混合感染疫病严重的形势下，由于联合用药能够降低药物的使用剂量和细菌的耐药性，并扩大疫病防治种类，因此，临床上抗生素联合用药，研制复方药物成为热点。氟苯尼考的抗菌机制是与细菌70S 核蛋白体50S 亚基上的A 位点结合，抑制肽酰基转移酶活性，从而抑制肽链的延伸，干扰细菌蛋白质的合成[10]。内服和肌肉注射均能表现出吸收迅速、扩散广泛、半衰期长、血药浓度高等特点，且能较长时间地维持血药浓度[11]。猪内服氟苯尼考后吸收迅速，给药5 min 后即可在血液中测到，且血药浓度较高，Cmax为9.87 mg／L，AUC 值为132.08 mg/（h·L），消除缓慢[12]。硫酸粘菌素抗菌机制在于其吸附在细胞膜表面，药物分子中带正电荷的游离氨基可与细菌细胞膜中带负电荷的磷酸盐结合，使细胞膜的表面张力降低和通透性增加，细胞内容物外漏，导致细菌死亡[13]。2 种抗生素抗菌作用机制不同，为联合用药提供了条件和可能。

单独使用抗生素的耐药性试验表明，氟苯尼考对大肠杆菌的MIC 值在1～128 μg/mL，抗菌效果较差，而对链球菌的MIC 值在0.125～1 μg/mL，比较敏感，抗菌效果优于大肠杆菌。硫酸粘菌素对链球菌的MIC 在32～128 μg/mL，抗菌效果很差，不如对大肠杆菌的效果好。这与养猪场抗生素使用不科学及长期使用一种抗生素有关，应引起注意，尽量轮换用药，不盲目加大剂量。

联合用药的敏感性研究结果显示，2 种抗生素FIC值均小于或等于1 μg/mL，说明联合用药可以协同或增加药物效果。康宇[14]等报道，氟苯尼考与硫酸粘菌素联用对猪大肠杆菌、链球菌均比单独用药效果有明显增强，均呈现协同作用。李赛等[15]报道，硫酸粘菌素与氟苯尼考联合用药对大肠杆菌的FIC 值≤0.5，为协同作用，抑菌效果比单一用药提高2～8 倍。本研究结果与上述结果基本一致。