真菌毒素检测技术研究现状与进展<br/>——基于CiteSpace分析

真菌毒素检测技术研究现状与进展
——基于CiteSpace分析

2024-01-09杜要文姚锋李传鹏常国立蔡成岗陈登

食品工业 2023年12期

杜要文，姚锋，李传鹏，常国立，蔡成岗，陈登

1.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室（杭州 310023）；2.浙江省科技信息研究院（杭州 310007）

真菌毒素是真菌在谷物、油料、水果等原料及其加工的食品或饲料等产品里生长所产生的有毒次级代谢产物，对人体和动物的健康都有极大危害，如黄曲霉毒素具有致癌、致突变和致畸形的破坏性，呕吐毒素在饲料中过高会导致畜禽呕吐、厌食、腹泻、发烧等中毒症状。已知真菌毒素有400多种，因毒性危害和污染情况经常检测的几种毒素有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲毒素、T-2毒素和伏马毒素等。真菌毒素除危害人畜健康外，还导致农产品品质下降，对农产品出口产生极大负面影响，对农户和农业经济造成巨大损失[1]。因此，如何控制真菌毒素在食品、饲料与农产品中含量的研究显得尤为重要。GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》明确规定食品中黄曲霉毒素B1（AFB1）不得超过20 μg/kg，黄曲霉毒素M1不得超过0.5 μg/kg，脱氧雪腐镰刀菌烯醇不得超过1 000 μg/kg，展青霉素不得超过50 μg/kg，赭曲霉毒素A不得超过5.0 μg/kg，玉米赤霉烯酮不得超过60 μg/kg[2]。基于限量标准的检测技术和方法开发，并针对可能含有真菌毒素的原料和产品进行分析检测，对保障食物和食品与饲料等产品的安全具有重要意义。

为更好阐述我国在真菌毒素安全检测方面的工作进展，试验通过CiteSpace软件梳理真菌毒素检测的研究脉络，通过更加直观形象的图示探索该领域的文献研究变化、研究热点趋向等内容，为实现发展和建立简单、快速、绿色、经济、准确、灵敏和多种毒素检测技术开发提供思路。

1 数据收集和研究方法

以2000—2023年“中国知网”中“毒素检测”为主题，筛选出主要主题包含检测方法、黄曲霉毒素与真菌毒素等的1 388篇文献，并以此为样本进行可视化分析，采用CiteSpace可视化分析软件工具[3-4]，对研究现状进行总结。

2 特征分析

2.1 主要的检测方法及进展

真菌毒素自发现后在检测方法、定量依据、检测限和定量限等方面进行研究，文献数量从2000年开始呈现逐年上升的态势，其中2013年为100篇，发文年限与数量的关系如图1所示。

图1 真菌毒素检测研究发文量趋势图

图1可以反映不同年限的发文数量，检测方法也逐步呈现变化，毒素最早测试是通过目测法检测，通过视觉判断，逐步得到多种方法。

2.1.1 基于生物学原理的方法

包括利用酵母生长和黄质醇氧化等方法，可以检测到某些真菌毒素。Mitterbauer等[5]开发一种灵敏的酵母生物测定法，无需进一步的净化步骤即可检测谷物提取物中玉米赤霉烯酮（ZEN）的雌激素活性；该方法灵敏度高，成本低，具有作为基础研究的潜力。

2.1.2 物理化学分析方法

包括气相色谱、高效液相色谱与电化学免疫传感器等技术，可对真菌毒素进行直接定量和种类鉴定。Lü等[6]研究一种很有前景的无标记电化学发光免疫传感器，该方法以鲁米诺-AgNPs@MC为抗体载体和用于检测AFB1的传感平台AgNPs通过银-氨基键与鲁米诺和抗AFB1结合，进一步增强灵敏度。Zhao等[7]使用基于QuEChERS（快速、简单、廉价、有效、稳定和安全）的植物油提取程序，采用高效液相色谱-串联质谱对16种化学多样化的霉菌毒素进行定量和确认。

2.1.3 快速检测试纸条法

将特定的抗体或亲和素固定在检测试纸上，使其对真菌毒素具有高选择性和灵敏度，可实现快速检测真菌毒素的含量和种类。许会静等[8]用胶体金标记T-2毒素单克隆抗体，通过测定加入不同量碳酸钾后吸光度的变化，确定标记的最佳pH，通过与抗原进行正交试验确定最佳组合条件，应用胶体金定量读数仪通过检测线和对照线的对比，检测试纸条的性能，T-2毒素胶体金快速定量检测试纸条可用于玉米中T-2毒素含量的快速定量检测。蔡其洪[9]利用单克隆抗体设计的固相免疫分析法以及金标试纸法可对黄曲霉素进行一步式检测，定性检测准确度在85%以上，灵敏度4 ng/mL可测出样品中20 ng/g的黄曲霉毒素。

2.1.4 分子生物学方法

包括基于聚合酶链反应（PCR）技术、DNA杂交检测等，可基于真菌的基因进行检测，并据此判断是否存在真菌毒素。PCR诊断已被用作替代检测方法，取代繁琐且耗时的微生物和化学方法，用于检测和鉴定真菌属镰刀菌、曲霉菌和青霉菌中最严重的毒素产生者[10]。由于PCR技术具有简单、快速、特异性强和灵敏高等优点，刘继超等[11]提出了PCR技术在检测肠毒素的应用，具体包括常规PCR、多重PCR、逆转录PCR以及荧光定量PCR，为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持。

2.1.5 光谱学方法

包括质谱、近红外光谱与拉曼光谱等技术，可通过分子振动和吸收波长差异性对真菌毒素进行检测。拉曼光谱（SERS）间接检测技术又被称为SERS标记检测技术，其原理是利用特殊的SERS探针示踪，通过对探针上标记物的检测和分析，实现对目标分析物的定性或定量分析[12]。陈明明等[13]利用便携式拉曼光谱仪建立一个快速筛查与检测谷物中真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的表面增强SERS方法，制备具有高活性的水凝胶SERS芯片，优化影响水凝胶SERS芯片对DON的SERS响应的实验条件，实现在小麦粉中DON的检测，所得回收率为97.3%～103%，相对标准偏差为4.2%～5.0%。

2.2 主要研究领域

通过对文献分析，制作表1，通过2个时间段的对比发现毒素检测的研究学科领域包括轻工、畜牧与动物学、预防医学与卫生学、生物学等领域，近年化学专题研究领域发表论文量增加较多，而排在前3位的轻工与畜牧均涵盖食品与饲料的生产、制作，由此可知食品毒素检测领域始终受到社会及研究者的重点关注。

表1 2000—2012年和2013—2023年毒素检测发表论文量前十名的研究方向对比情况

另外，在食品工业领域，霉菌能在粮食和饲料中腐生或寄生后产生大量有毒代谢产物（毒素），有些毒素的毒力极强，对人畜健康产生极大的危害作用，这些毒素具有抗热能力，通常加热不能将其破坏，当人或畜、禽采食霉变的粮食制品或饲料后就会发生多种中毒病[14]，因此毒素检测至关重要，特别是新方法和新技术的探索与应用。

3 研究趋势及发展特征分析

研究热点是真菌毒素检测领域重要内容，通过关键词聚类分析，认定文献中出现的频次及中心性作为研究热点进行分析。

3.1 基于关键词共现的研究热点分析

在CiteSpace中，若中心性（centrality）超过0.1的节点，则说明该节点为中心节点，在研究中较为重要且具有较大的影响力。图2展示关键词共现聚类网络，其中圆环越大代表相关研究出现的频次（frequency）越多，圆环由内到外的不同颜色分别表示由远及近相关研究的不同年份，据统计位列前5位的依次是检测（frequency=134，centrality=0.34）、真菌毒素（frequency=134，centrality=0.24）、快速检测（frequency=62，centrality=0.16）、肠毒素（frequency=41，centrality=0.15）、检测方法（frequency=71，centrality=0.10），说明毒素检测是推进真菌毒素发展的重要内容，与此同时要兼顾快速检测技术，进而实现真菌毒素检测与快速检测的联合发展，这也是未来真菌毒素检测发展研究的重点。另外，针对呕吐毒素（frequency=36，centrality=0.05），说明对该毒素检测的研究还不是特别深入，未来有很大的发展空间。

图2 关键词共现图谱

通过梳理关键词的聚类图谱分析发现，真菌毒素、检测与快速检测是研究重点（图3）。作为一种新型识别分子的适配体检测技术，具有很强的特异性和稳定性，可作为ELISA方法中抗体的一种代替物，也可作为化学和生物传感器检测方法中的识别元件[15]。秦美君等[16]以赭曲霉素（OTA）核酸适配体为识别原件，小檗碱为荧光探针发展一种无标记的荧光体系检测OTA，该方法有较高的特异性，并成功应用于中药桔梗中OTA的检测，回收率在86.3%～105.6%。Ramezani等[17]基于核酸外切酶I（Exo I）、核酸适配体互补链（CS）、核酸适配体（Apt）-CS偶联物的拱形结构和金电极的组合，开发用于链霉素灵敏和选择性检测的电化学适体传感器，所设计的电化学适体传感器对链霉素表现出高选择性，检测限低至11.4 nm，所开发的电化学适体传感器成功用于检测牛奶和血清中链霉素。在真菌毒素检测技术被重视的同时，对真菌毒素的毒素基因与原核表达也被部分研究者关注，以期得到相应的抗体，使感染真菌毒素的生物体得到早期诊断治疗。

图3 关键词的聚类图谱

3.2 基于突现分析方法的前沿分析

关键词共现的Timeline图是根据考察关键词在时间轴上的分布，从而挖掘该领域内研究前沿主题，而通过突现率可以发现在该段时间内相关文献的研究重点，并通过关键词可知未来一段时间内该领域的研究方向。

通过梳理2017—2023年文献发现，快速检测、真菌毒素及检测方法基本是同步发展的（图4）。

图4 关键词共现的Timeline图

快速检测时间线上，免疫检测技术的发展先后经历：最初的放射免疫法，即利用具有特异性的抗体或抗原，通过与放射性示踪物相结合的方式检测食品中的各类毒素；发展到ELISA技术，以对毒素高度特异性的抗体为识别分子，通过抗体与毒素结合反应的方式进行检测；再到电化学分析技术、荧光分析技术和生物传感器等新技术的研究，推动免疫检测技术的快速发展，并取得重大进展；再到适配体技术、质谱技术和纳米颗粒技术等新兴技术，不仅提高检测灵敏度和准确性，而且还拓宽检测范围和适用领域。

在农产品和粮食领域，由于真菌生长有一定的地域性，不同区域占优势的真菌毒素种类也不同，如在亚热带和热带地区，农产品和饲料主要被黄曲霉素和某些赭曲毒素污染；而玉米赤霉烯酮、呕吐霉素、赭曲霉毒素A、T-2毒素、烟曲霉毒素则在温带地区占有显著优势[18]。从全球范围来看，食品安全问题经常是由谷物、坚果、水果和绿色咖啡豆上的真菌毒素所造成，其中，以花生和玉米的污染最为严重。因而真菌毒素的无损检测技术得到较快发展，包括光谱学技术（如近红外光谱、中红外光谱、拉曼光谱、荧光光谱）、太赫兹时域光谱成像技术（如高光谱及多光谱成像、彩色成像、热成像、X射线成像）及电子鼻技术等[19]。无损检测技术通常应用于玉米及小麦中真菌及毒素的检测，未来无损检测技术还需进行深入研究，如在短时间内对不同农产品中的多种真菌或毒素进行同时分析，利用更大的数据集和先进的化学计量学软件开发更稳健的校准模型，以及提高检测结果的灵敏度、准确性和重复性等，随着设备及仪器价格的降低和新算法的发展，这些无损快速的检测技术将对农业真菌和真菌毒素污染检测有更大价值[20]。随着这些技术的发展，使检测食品及农作物中相关毒素更加简便且准确度更加可靠，便利了对真菌毒素的风险评估，有利于如今粮食的贮存，增大了储粮安全系数，使食品安全得到相对更好的保障性。

通过对已有文献中关键词突现图谱（图5）分析发现，2017—2018年霉菌毒素污染饲料原料成为研究热点。据我国饲料霉变情况调查报告，真菌的检出率和含量，南方地区大幅高于北方地区，特别是5—9月份，南方地区的平均气温都处于20 ℃以上，平均相对湿度在80%以上，这种高温高湿的环境条件下，真菌生长繁殖最为旺盛，谷物饲料霉变率高；北方的夏季高温低湿，不易霉变，常因加工、运输或贮存不当而产生真菌毒素[21]；因此发展灵敏度高、响应迅速、专业性强的胶金体免疫层析技术[22]检测毒素，用于食品、饮料、农产品和环境中毒素的检测。

图5 关键词突现图谱（提取前12个）

2019—2021年这一时间段的研究热点主要集中在针对中药材与食物中的真菌毒素，旨在保证中草药的质量和有效性，《中华人民共和国药典》[23]中有详细的中药材真菌毒素检测的官方规范方法，主要适用于玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素，以及多种真菌毒素，常采用高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱联用技术[24-26]及酶联免疫吸附技术（ELISA）[27]和免疫层析技术[28]分析。

近2年荧光技术与纳米材料检测毒素成为研究热点。一方面，荧光光谱法（FS）是一种利用物质荧光性质进行快速无损检测的方法[29]。该方法已广泛应用于农产品中真菌毒素的检测[30]，并且激光诱导荧光（LIFS）、单光子诱导荧光在真菌毒素检测中应用较广泛[31]。黄曲霉毒素AFB和AFG在受到紫外线照射时会产生青黄色荧光，这使得FS分析黄曲霉毒素的侵染成为可能[32]。另一方面，纳米材料因其具有高比表面积、独特的物理化学性质和生物兼容性，被广泛应用于毒素检测中，在对毒素进行检测时，纳米材料可作为检测试剂或者载体，常用的纳米材料可以分为金属纳米粒子、量子点、碳纳米管等。以金属纳米粒子为例，如利用纳米金颗粒表面的抗体与毒素结合的特异性，可以制备出高灵敏度的适配体传感器可用于不同毒素的同时检测[33]。另外，也可将纳米材料与萃取、PCR等技术相结合，提高毒素检测的灵敏度和准确性。纳米材料还被应用于直接筛查食品、水源、空气等环境中的毒素，例如利用碳纳米管构建纳米电极来实现农业食品中霉菌毒素的检测。不足之处是在使用荧光光谱法进行毒素检测时，需要选择合适的荧光染料以及适宜的激发波段、检测波段和检测时间等条件，以获得最准确的检测结果。同时前处理方法和纳米材料的安全性等问题也需提升。

4 结论与展望

通过CiteSpace对“中国知网”上以毒素检测为主题分析其研究进展，结果表明轻工业手工业领域研究最多，其他如畜牧与动物学、预防医学与卫生学也是该领域主要的研究方向，分析用于粮食、饲料、中药材等的真菌毒素快速检测技术及最新方法，如适配体检测技术、免疫检测技术、荧光技术与纳米材料基础上的检测方法等。随着科技水平的进步，真菌毒素分析研究会呈现以下的主要趋势。

4.1 真菌毒素检测速度更快

近年来新兴技术已在真菌毒素检测速度方面取得重大突破。如高通量平台和人工智能算法的使用，可在更短时间内同时检测多种真菌毒素，检测结果可在几分钟到几小时内得出。此外，分子生物学技术的不断发展也推动快速检测方法的出现。如PCR、LAMP等分子诊断技术，可在不需要培养真菌的情况下，通过检测其基因特征来快速识别和定位不同毒素形式，大幅缩短与传统检测方法相比的时间。这些创新无疑将加速真菌毒素检测过程，并提高其精确性和可靠性。

4.2 真菌毒素检测的精确性和灵敏度提高

现代分子生物学、免疫学和纳米技术等新技术的运用，使得真菌毒素检测精准度和灵敏度得到很大提高。如聚集诱导发光剂（AIEgens）可提高检测灵敏度和通量，抑制传统荧光纳米材料在聚集时易引起的猝灭效应。此外，纳米技术也可用于制备高效、高灵敏度检测指示剂和自动化检测芯片等检测器件。这些将促使真菌毒素检测提高其精确性和可靠性。

4.3 真菌毒素检测方法更加简便

高通量平台或人工智能算法可同时检测多种真菌毒素，而且操作简单，不需要经过专业人员长时间的培训。一些商业化的检测试剂盒也使得真菌毒素检测变得更为简便和快捷。此外纸基检测技术已被开发用于检测食品和饮料中的真菌毒素，该技术使用的芯片可大幅缩短检测时间，并且成本较低，可进行定量分析，有望广泛应用于实际测试。