佤药远志醇提物对斑马鱼的助眠作用

余熙，赵智全，吴海强，吴序栎

（1.深圳市创华生物医药有限公司，广东深圳 518000）（2.深圳大学医学部药学院，广东深圳 518000）（3.深圳大学医学部公共卫生学院，广东深圳 518000）

失眠是所有年龄段最常见的睡眠障碍[1]，通常表现为不易入睡，睡后易醒，睡眠深度或频度过短、早醒及睡眠时间不足或质量差等，长时间的失眠会导致神经衰弱和抑郁症，对患者生活造成极大影响[2,3]。现代生活节奏快、作息不规律、心理压力大，大多数人处于亚健康状态，几乎都有过失眠经历，慢性失眠病程长，可长达10 年以上，严重影响人们的生活质量和身心健康[4-6]。据世界卫生组织（WHO）调查结果显示，全球将近1/3 的人深受睡眠障碍问题困扰[5-7]。《中国睡眠研究报告（2022）》显示，64.75%的国人每天实际睡眠时长不足8 h[8]。流行病学研究表明，我国约有45.4%的老年人存在睡眠障碍问题[9]，成年人失眠发生率高达38.2%，已超过欧美等发达国家，并且呈上升趋势[10,11]。

目前，治疗失眠的药物主要是指西药安眠药，如安定、佐匹克隆片、思诺思等，但需频繁用药和长期服用，其不良反应如中枢神经紊乱、依赖性、记忆力下降、性格改变、肾脏损害等问题也较多[12]。相较之下，中药治疗失眠的优势尤其突出，药物的副作用小，对机体的伤害较小，比较适合长期调理服用，既不会形成药物依赖，也不会出现药物的戒断反应，可以依据病情随时停药[2]。中药治疗失眠是从病因入手，从根源上治疗，同时还可以改善机体的身体素质，效果显著且具有独特的优势[13]。

佤族医药作为我国民族医药的重要组成部分，其药食同源是佤族医药的一大特色，是沿用至今的保健及治疗方法[14]。佤药远志（Polygalatenuifolia），又名娘母良（Polygalacrotalarioides，佤文：Nya Miex Tiang），属远志科远志属多年生草本植物，为佤族稀有珍贵药材，也是一味中医常用的中药，性善疏泄通达，是交通心肾、安定神志之佳品，具有益智安神的功效[15-17]。临床上常应用于治疗失眠多梦，健忘惊悸、肾虚阳萎、宫寒带下等症，并且佤族民间早已验证其强壮、增力、抗疲劳等作用[15-17]。现代药理学研究表明，其主要成份细叶远志皂苷能通过抑制去甲肾上腺素，增强对小鼠的催眠作用，是远志发挥镇静安神效果的主要物质之一[18-20]。

当前，随着我国居民生活水平不断提高，消费升级，人们的保健意思不断增强，健康产业具有广阔的发展前景[21]。因此，开发一款绿色健康、安全性高的睡眠友好型保健食品，意义非常重大，市场前景非常广阔。本文选取佤药远志为研究对象，采用高效液相色谱法（HPLC）检测远志的主要活性成分及含量，以斑马鱼为实验动物模型，比较其不同剂量对于改善睡眠的作用，旨在探索佤药远志的助眠功效，为针对性治疗失眠，远志深加工及开发保健食品提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

远志，产于云南，购自西安天行健天然生物制品有限公司；野生型AB 品系斑马鱼（许可证号为：SYXK(浙)2022-0004 ）；远志酮 III（批号111850-202006）、3,6’-二芥子酰基蔗糖（批号111848-202006）对照品，均购自中国食品药品检定研究院；细叶远志皂苷（批号LP12560）对照品，购自河南标准物质研发中心；二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO；批号BCCD8942），购自美国Sigma-Aldrich 公司；褪黑素（批号F1804064），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊四唑（Pentylenetetrazole，PTZ；批号A27O8L46880），购自上海源叶生物科技有限公司；3516 六孔板，购自美国Corning Incorporated 公司；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，购自广州彼西络科技有限公司；色谱分析用水为娃哈哈纯净水，其它实验用水为去离子水。

1.2 实验仪器

LC-2030C（3D）高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司；CP214 精密电子天平，美国OHAUS 公司；电热恒温干燥箱，上海昕仪仪器仪表有限公司；1000Y高速多功能粉碎机，欧橡；98-1-1-B 型电子调温电热套，天津市泰斯特仪器有限公司；SB25-12DTD 型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；JK-VWS 振动筛，上海精学科学仪器有限公司；SZX7解剖显微镜，日本OLYMPUS 公司；Zebra Lab 3.22.3.31 行为分析仪，法国ViewPoint Life Sciences 公司；VertA1CCD 相机，上海土森视觉科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 远志醇提物制备称取50 g 远志粉碎，过三号筛后，置于圆底烧瓶中，精密加入体积分数65%乙醇200 mL，煮沸1 h，放冷，摇匀后滤过，取沉淀物重复提取2 次，最后合并3 次上清液浓缩至20 mL，得远志乙醇提取物（2.5 g/mL）。

1.3.2 远志醇提物活性成分检测

1.3.2.1 对照品溶液制备

参照《中国药典》2020 年版，分别取细叶远志皂苷对照品2.0 mg、远志酮III 对照品1.5 mg、3,6’-二芥子酰基蔗糖对照品2.0 mg，精密称定，甲醇溶解并超声，摇匀，最后加甲醇稀释得细叶远志皂苷1 mg/mL、远志酮III 0.15 mg/mL、3,6’-二芥子酰基蔗糖0.2 mg/mL，用0.22 μm 微孔滤膜抽滤之后，再进样。

1.3.2.2 供试品溶液制备

按“1.3.1”项下原材料预处理方法制备远志提取物，取1 mL 远志提取物置于100 mL 量瓶中，加蒸馏水溶解并摇匀，稀释至刻度，得供试品母液。精密吸取供试品母液1 mL，加蒸馏水稀释至1 mg/mL，过0.22 μm 微孔滤膜后，再进样。

1.3.2.3 色谱条件

参照《中国药典》2020 年版测定细叶远志皂苷含量[22]。色谱条件：检测波长为210 nm；色谱柱为ShimNex CS C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.05%磷酸溶液（70:30，V/V）；柱温25 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL。

1.3.3 不同质量浓度远志醇提物改善睡眠作用

1.3.3.1 PTZ 诱导的斑马鱼失眠模型的建立

随机选取野生型AB 品系斑马鱼（自然成对交配繁殖，年龄为受精后5 d）于六孔板中，每孔容量3 mL，600 μg/mL 戊四唑刺激1 h，建立PTZ 斑马鱼失眠模型。

1.3.3.2 斑马鱼最大耐受浓度测定（Maximum Talerated Concentration，MTC）

测定MTC 参考文献[23]的方法并略有修改。设置正常对照组、PTZ 模型对照组以及5 个不同质量浓度远志醇提物处理组（125、250、500、1 000、2 000 μg/mL）。每组随机挑选30 尾斑马鱼置于六孔板中，每孔30 尾，每孔容量为3 mL。28 ℃处理1 d 后，观察统计各组斑马鱼死亡数量和死亡率，测定MTC。

1.3.3.3 远志醇提物改善斑马鱼失眠功效实验

参考文献[23]设计远志醇提物改善斑马鱼失眠功效实验，有修改。将随机选取的斑马鱼置于六孔板中，每孔30 尾斑马鱼，每孔容量为3 mL。设置正常对照组和PTZ 模型对照组，另选取斑马鱼失眠模型，设置4 个不同质量浓度远志醇提物处理组（125、250、500、1 000 μg/mL）以及阳性对照褪黑素质量浓度组125 μg/mL（见表2）。28 ℃处理1 d 后，每组随机取10 尾斑马鱼采集数据，分析斑马鱼觉醒活动量（D）和觉醒总时间（S），以此来评价远志的助眠作用。助眠作用计算公式如下：

式中：

ER——远志醇提物改善斑马鱼睡眠作用率，%；

D0——模型组斑马鱼觉醒活动量，mm；

D1——处理组斑马鱼觉醒活动量，mm。

1.4 数据处理及统计分析

实验数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA），进行各个实验组间的差异分析，实验结果以平均数±标准差（mean±SE）表示。通过GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析处理，P＜0.05 被认为具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 远志醇提物活性成分含量测定

按“1.3.2.1”和“1.3.2.2”项下方法，分别制备对照品及供试品溶液，按“1.3.2.3”项下色谱条件检测，面积归一法计算远志样品中细叶远志皂苷、远志酮III、3,6’-二芥子酰基蔗糖的含量。结果显示细叶远志皂苷质量分数为7.61%、远志酮III 的质量分数为15.01%、3,6’-二芥子酰基蔗糖的质量分数为38.78%（表1）。2020 年版药典以要求细叶远志皂苷含量不低于2%，远志酮III 含量不低于0.15%、3,6’-二芥子酰基蔗糖含量不低于0.5%，本实验方法所提取的远志的主要活性成分远远高于药典要求。本实验结果与张琳等[22]研究结果相比，三种主要活性成分均高于其研究的5 种野生远志。大量研究表明，远志属植物化学成分类型非常丰富，主要含有皂苷、糖酯、酮类、生物碱、香豆素类等活性成分。本实验所用药材远志的三种主要活性成分细叶远志皂苷、远志酮III、3,6’-二芥子酰基蔗糖含量高，质量合格，其中3,6’-二芥子酰基蔗糖的代谢产物主要为3,4,5-三甲氧基肉桂酸（TMCA），而TMCA 具有镇静催眠的作用[24]，细叶远志皂苷能够通过调节γ氨基丁酸（GABA）能系统增强对小鼠的助眠作用[18]。因此，本文将进一步通过建立PTZ 诱导的斑马鱼模型，对远志进行改善睡眠功效评价。

表1 远志醇提物主要成分表Table 1 Analysis of Polygala tenuifolia alcohol extract components

2.2 斑马鱼最大检测浓度（MTC）

当远志质量浓度在125～1 000 μg/mL 时，处理组与正常对照组状态相似，没有出现死亡现象；当远志质量浓度为2 000 μg/mL 时，处理组5 与正常对照组相比，状态较差，且有斑马鱼死亡现象，死亡率为3%。因此将改善睡眠功效MTC定为1 000 μg/mL，详见表2。

表2 远志醇提物改善睡眠功效质量浓度摸索实验结果（n=30）Table 2 Polygala tenuifolia alcohol extract improved sleep efficacy concentration and explored the experimental results

2.3 远志醇提物改善PTZ 模型斑马鱼行为

如图1 所示，通过分析PTZ 模型斑马鱼行为轨迹发现，与正常对照组相比，PTZ 模型对照组的斑马鱼运动状态明显活跃，与PTZ 模型对照组相比，阳性对照褪黑素组有效减少了PTZ 模型组斑马鱼活动量，这表明成功建立了PTZ 诱导的斑马鱼失眠模型。通过每组30 尾斑马鱼的对比实验，发现经过远志醇提物处理之后，与PTZ 模型组相比，各处理组的斑马鱼躁狂症均有不同程度的缓解，其中1 000 μg/mL 远志醇提物相比阳性对照褪黑素组，改善睡眠效果更加显著。结果表明，远志醇提物具有一定的改善睡眠的功效。

图1 不同质量浓度远志醇提物处理后斑马鱼运动轨迹典型图Fig.1 Typical movement trajectories of zebrafish after treatment with different concentrations

2.4 远志醇提物改善PTZ 模型斑马鱼睡眠功效评价

如表3 所示，通过分析斑马鱼觉醒活动时间和活动量发现，PTZ 模型对照组中，斑马鱼觉醒时间（13.7 s）和觉醒活动量（531 mm），均远高于正常对照组的觉醒活动时间（1.82 s，P＜0.001）和觉醒活动量（45.7 mm，P＜0.001），与PTZ 模型对照组比较，阳性褪黑素组的觉醒活动时间（9.30 s，P＜0.05）和觉醒活动量（377 mm，P＜0.05）明显减少，这表明成功建立了PTZ 诱导的斑马鱼失眠模型。阳性褪黑素组改善睡眠作用为29.00%，远志醇提物4 个质量浓度处理组（125、250、500、1 000 μg/mL）改善睡眠作用依次为6.97%、22.78%、33.14%、47.26%，其中质量浓度为500 μg/mL 和1 000 μg/mL 的远志改善睡眠作用明显优于阳性褪黑素组。结果表明远志醇提物对PTZ 诱导的斑马鱼失眠症状具有明显的改善作用，但是在一定浓度范围内，呈剂量依赖性，浓度越高，作用越明显。本实验结果与陆婷婷[16]、任小娟等[25]研究结果相似，均表明远志具有助眠作用。远志对斑马鱼的助眠作用可能与其主要活性成分细叶远志皂苷和3,6’-二芥子酰基蔗糖有关，具体机制还需更深层次探索。

表3 不同质量浓度远志醇提物改善睡眠功效评价实验结果（n=10）Table 3 Experimental results of different concentrations of Polygala tenuifolia alcohol extract to improve sleep efficacy

3 结论

综上所述，本文通过建立斑马鱼失眠模型，测定MTC，将改善睡眠功效MTC 定为1 000 μg/mL。采用MTC 设置给药浓度，研究斑马鱼的行为轨迹，结果表明远志醇提物各质量浓度处理组与PTZ 模型对照组相比均有不同程度的改善。通过分析斑马鱼觉醒活动量和觉醒总时间，以此来评价远志镇静安神、改善失眠功效。结果显示阳性褪黑素组改善睡眠作用为29.00%，远志醇提物4 个质量浓度处理组（125、250、500、1 000 μg/mL）改善睡眠作用依次为6.97%、22.78%、33.14%、47.26%，其中质量浓度为500 μg/mL和1 000 μg/mL 的远志醇提物改善睡眠作用明显优于阳性褪黑素组。研究结果表明远志醇提物具有镇静安神的功效，能够改善睡眠障碍，但在一定质量浓度范围内，呈剂量依赖性。本文对于远志醇提物改善睡眠作用的机制尚未进行更深入的研究，后续还需要对远志进行更加细致的探索，为未来远志的临床应用和食品保健等提供参考依据。