富硒糙米不同碾磨级分米糠蛋白的硒含量及其功能特性

周雷，隋勇，梅新*，李书艺，许锐，施建斌，蔡沙，熊添，蔡芳，祝振洲*

（1.武汉轻工大学硒科学与工程现代产业学院，国家富硒农产品加工技术研发专业中心，湖北省绿色富硒农产品精深加工工程技术研究中心，湖北武汉 430048）（2.湖北省农学科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北武汉 430064）

水稻作为世界一半人口的主食，为人类直接贡献了20%以上的卡路里[1]。通常，人们通过剥离胚层和麸层将糙米碾磨成精米来进行消费。但与精米相比，全糙米保留了米糠中的营养物质，如必需脂肪酸、膳食纤维、维生素、矿物质、有益金属元素和植物活性物质[2-4]。流行病学研究表明，经常食用全谷物和相关产品可以降低患心血管疾病、II 型糖尿病、肥胖症和癌症等慢性疾病的风险[5,6]。

硒是人体必需的微量元素，参与体内多种重要的代谢途径，包括甲状腺激素代谢的合成、抗氧化防御系统（即作为谷胱甘肽近邻的活性中心）和免疫功能[7,8]。中国营养学会表示，成年人每天的硒摄入量应为50～250 μg。缺硒会导致许多健康疾病，例如克山病、癌症、心脏病、甲状腺功能亢进症等[7]。硒可以影响蛋白质的活性中心并增强其抗氧化能力，有机硒甚至可以直接参与清除自由基[9]。而富硒大米中含有90%（m/m）以上的以硒蛋白形式存在的有机硒，是作为日常膳食富硒的良好食物来源[10]。冯明菊等[11]发现，富硒处理可以有效提高糙米蛋白的抗氧化活性。胡玲玲等[12]发现，相对于发芽糙米蛋白，富硒发芽糙米蛋白具有更强的抗氧化能力。

糙米糠层富含纤维，因此蒸煮特性和适口性差。经适度碾磨后，可以提高谷物的烹饪质量，但同时也会导致营养物质的损失[2]。碾磨度（Degree of Milling，DOM）是影响大米感官质量和营养含量的关键参数。Zhang 等[13]系统地评价了总酚、总黄酮和总花青素在黑米不同米糠级分中的分布和生物活性，发现DOM为2%（m/m）的米糠级分中总酚、总黄酮和总花青素含量最高，并且显示出更强的抗氧化性，以及α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。Wang 等[14]研究了不同DOM 值的精制丝苗米的理化性质，发现随着DOM的增加，丝苗米中存在的蛋白质、脂肪、膳食纤维、烟酸和维生素E 逐渐被去除。孙瑞等[4]则探究糙米在碾磨过程中硒的损失，发现DOM 越大，硒的损失率越大。然而，目前关于糙米不同级分米糠及其米糠蛋白的硒含量分布和抗氧化活性的研究较少。

在这项研究中，以富硒糙米为原料，通过碾磨将米糠分为5 个级分，每个米糠级分约占整个糙米颗粒的2.2%（m/m）。比较了不同米糠级分及其蛋白的硒元素含量和蛋白的抗氧化活性、α-淀粉酶抑制能力。本研究可为制定合理的富硒糙米适度碾磨工艺参数和精米、米糠的综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料

供试富硒和常规晚粳稻“南粳9108”（NR），晚籼稻“巨2 优60”（JR）、“野香优航1573”（YR），由湖北省农业科学院农业经济技术研究所富硒稻米团队提供。所有水稻品种在2021 年5 月30 日播种，富硒稻是在灌浆初期通过叶面喷施硒肥，10 月6 日收割，经干燥、砻谷得到对应品种和处理的糙米。

Agilent 混合内标溶液（5188-6525）美国Agilent公司；2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、阿卡波糖上海源叶生物科技有限公司；α-淀粉酶、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美国Sigma公司；硝酸（优级纯）、水杨酸、过氧化氢、TPTZ、过硫酸钾、三氯化铁、硫酸亚铁、可溶性淀粉、L(+)-抗坏血酸，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7900 型电感耦合等离子体质谱仪，美国Agilent公司；Multiwave PRO 型微波消解仪，奥地利安东帕有限公司；Milli-Q Syhthesis 超纯水系统，美国Millipore 公司；722N 可见分光光度计，上海仪电分析仪器公司；LGJ-25C 冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；SB-5200D 超声波清洗机，宁波新芝生物科技公司；K9840 自动凯氏定氮仪，济南海能仪器有限公司；SXJMJ-858 型精米机，浙江台州华晨粮油机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

根据Zhang 等[13]的方法，略作修改。使用SXJMJ-858 型精米机对糙米相继碾磨获得5 种不同的米糠级分。碾磨步骤如下：使用碾米机将新鲜WBR（Whole Brown Rice，全糙米）（200 g）碾磨2 s，得到糠层部分1（BF1）和碾米1。之后，将碾米1 碾磨1 s 以获得BF2 和碾米2。然后依次将上一步中的碾米碾磨2、3 和10 s，以获得BF3、BF4 和BF5，每个米糠级分约占整个糙米颗粒的2.2%（m/m）。所有麸皮馏分和碾磨后的精米（MR6）都被研磨成细粉，过80 目筛。然后将每个样品密封并储存在-20 ℃直至分析。

1.3.2 硒含量测定

硒含量的测定参照GB 5009.93-2017《食品中硒的测定》中电感耦合等离子体质谱法，稍作修改。准确称取0.2 g 样品，加入8 mL HNO3，振荡混匀后放入微波消解仪中消解，消解结束后放至冷却，于电热板上180 ℃赶酸至消化液剩余体积为约1 mL，冷却后转移至10 mL 容量瓶中，用2%（V/V）HNO3定容、混匀，待测。取Agilent 标配内标溶液（10 mg/L），以5%（V/V）HNO3逐级稀释至100 μg/L，取此内标稀释液以5%（V/V）HNO3分别配制相当于硒元素标准0、3.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的内标液。选择Se为待测元素，Ge 为所需内标。依次将样品消化空白液、不同浓度内标液及样品制备液导入 ICP-MS（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，电感耦合等离子体质谱）进行测定，由设定的仪器参数自动计算被测组分硒的浓度。样品测定的标准曲线方程为：Y=0.0041X+1.6333E-004，线性相关系数为：0.9999。由公式（1）计算硒含量（TSe）：

式中：

TSe——硒含量，mg/kg；

C——由标准曲线测得的供试溶液中硒的浓度，ng/mL；

C0——由标准曲线测得的空白液中硒的浓度，ng/mL；

V——试样消化液总体积，mL；

m——待测样品的质量，g；

1000——换算系数。

1.3.3 米糠蛋白提取

参考王雪等[15]的方法，略作修改。采用碱溶酸沉法进行制备，称取上述制备好的不同级分米糠粉末，加入正己烷（m/V=1:4）后搅拌脱脂4 h，通风干燥过夜。加入0.1 mol/L NaOH 溶液（m/V=1:6）于40 ℃恒温水浴搅拌2 h。结束后在8 000 r/min 下离心15 min，得到上清液，用盐酸调节pH 值至5.0，再次在8 000 r/min 条件下离心15 min，得到蛋白质沉淀，调节pH 为中性后水洗两次，透析，冷冻干燥，得到米糠蛋白样品。依据GB 5009.3-2016，采用自动凯氏定氮法测定所提蛋白纯度。按式（2）计算米糠蛋白提取率（E）：

式中：

E——米糠蛋白提取率，%；

M1——所提米糠蛋白的质量，g；

P——所提米糠蛋白的纯度，g/100 g；

M0——米糠原料中蛋白质含量，g/100 g。

1.3.4 抗氧化性测定

1.3.4.1 DPPH·清除活性的测定

参考Chen 等[16]的方法，稍作修改。涡旋2 mL 样品溶液（0.6 mg/mL）和2 mL DPPH 溶液（0.2 mmol/mLφ=95%乙醇）的混合溶液。将混合溶液在黑暗中静置30 min，以φ=95%乙醇溶液为参比，测量517 nm 处吸光度值A2。2 mL 的去离子水与2 mL DPPH 溶液为对照组，空白组为2 mL 样品溶液与2 mLφ=95%乙醇溶液，以抗坏血酸为对照并绘制标准曲线（y=45.797x-0.087 2，R2=0.992 4）。按式（3）计算DPPH自由基清除率（SRDPPH）：

式中：

SRDPPH——DPPH 自由基清除率，%；

A2——试样与DPPH 溶液反应后的吸光度值；

A1——试样吸光度值；

A0——DPPH 溶液吸光度值。

1.3.4.2 ABTS+·清除能力测定

参考Huang 等[17]的方法，稍作修改。通过将ABTS溶液（7 mmol/L）与等体积的过硫酸钾溶液（2.45 mmol/L）混合并在黑暗中反应12～16 h 获得ABTS 储备溶液。使用前将该溶液用PBS（pH 值7.4）稀释至0.7（734 nm）的吸光度值。将0.5 mL 样品溶液（0.6 mg/mL）加入3 mL 稀释的ABTS 溶液中。室温避光30 min 后，在734 nm 处测定吸光度。以抗坏血酸为对照并绘制标准曲线（y=0.000 4x+0.000 9，R2=0.999 3）。ABTS+自由基清除率（SRABTS）用公式（4）计算：

式中：

SRABTS——ABTS+自由基清除率，%；

A5——空白（不含ABTS）体系中样品的吸光度值；

A4——试样吸光度值；

A3——PBS 溶液代替试样测量的吸光度值。

1.3.4.3 ·OH 清除能力的测定

参考冯明菊等[11]的方法，稍作修改。在试管中依次加入1 mL 9 mmol/L 的硫酸亚铁、1 mL 9 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液，摇晃均匀，再加入1 mL 0.6 mg/mL的样品溶液，添加1 mL 8.8 mmol/L 的过氧化氢溶液启动反应，用超纯水定容至10 mL，涡旋后在37 ℃水浴15 min，超纯水为参比物，测定510 nm 处的吸光度。以抗坏血酸为对照并绘制标准曲线（y=0.005x-0.006，R2=0.998 2），计算清除率。按式（5）计算羟基自由基清除率（SROH）：

式中：

SROH——羟基自由基清除率，%；

A8——加入试样后的吸光度值；

A7——以超纯水替代过氧化氢溶液后的吸光度值；

A6——未加入试样溶液的吸光度值。

1.3.4.4 铁离子还原能力的测定

参照Quinteros 等[18]的方法，稍作修改。FRAP 试剂通过混合25 mL 300 mmol/L 醋酸钠缓冲溶液（pH值3.6）、2.5 mL 10 mmol/L TPTZ（稀释在40 mmol/L HCl）、2.5 mL 20 mmol/L 六水合氯化铁制备，37 ℃预热后使用。将0.1 mL 样品与2 mL FRAR 试剂混匀，室温下避光30 min，测定在515 nm 处吸光度。超纯水作为空白对照，以抗坏血酸为对照并绘制标准曲线（y=0.029 2x-0.001 4，R2=0.996 4），结果以每100 g样品对应的抗坏血酸当量表示。

1.3.5α-淀粉酶抑制活性的测定

参照刘晓飞等[19]的方法，稍作修改。将α-淀粉酶（2 U/mL）溶液与0.2 mL 样品溶液（1.2 mg/mL）混合，于37 ℃水浴10 min，加入5%（m/V）的淀粉溶液0.3 mL，37 ℃水浴15 min。加入DNS 试剂2 mL，沸水浴15 min，于540 nm 测定吸光值。按式（6）计算α-淀粉酶抑制活性（IR）：

式中：

IR——α-淀粉酶抑制活性；

B0——不加试样后α-淀粉酶溶液的吸光度值；

B——不加试样和α-淀粉酶的吸光度值；

B2——加入试样和α-淀粉酶的吸光度值；

B1——未加入α-淀粉酶的试样溶液的吸光度值。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0 进行统计分析，结果以平均值±标准差表示，组间存在显著性差异（P＜0.05），则采用Duncan 检验进行组间多重比较，利用Pearson 进行相关性分析。采用Origin 2020 绘图软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 三种糙米及其不同级分米糠蛋白硒含量

2.1.1 富硒糙米中硒含量

对富硒处理前后的稻米硒含量进行测定，结果如表1 所示，其中，富硒处理前稻米硒含量在35.80～68.44 μg/kg 之间，处理后，硒含量显著增加到356.78～1 065.67 μg/kg，可以发现不同稻米品种间的硒载量和硒储藏能力有较大差异（P＜0.05），这可能是控制水稻Se 运输能力的茎节位NRT1.1B 基因表达水平的差异所导致的[20]。此外，南粳9108（NR）、巨2 优60（JR）、野香优航1573（YR）的蛋白含量分别提升了6.48%、13.74%和6.12%，说明富硒处理提高了稻米的蛋白含量。导致蛋白质含量显著性差异的原因可能是硒元素与半胱氨酸、蛋氨酸结合，形成的硒代氨基酸化合物以硒蛋白的形式转运储存于蛋白质中造成的[21]。

表1 富硒糙米中总硒含量和蛋白质含量Table 1 Total selenium and protein contents in selenium-rich brown rice

2.1.2 不同富硒糙米米糠级分硒含量和蛋白含量

由图1a、1b 图可以看出，不同品种富硒和普通糙米中的硒元素主要集中于BF1～BF4 的米糠部分中，随着碾减率的增加，硒含量会先增加，在BF3（DOM 6.12%～7.82%）处达到最高，随后显著降低，于精米中达到最低值。有研究发现，富硒糙米中蛋白质含量与硒含量显著相关[22]。不同级分富硒糙米米糠蛋白含量的变化如图2 所示，蛋白质主要分布在BF1～BF5级分中，在BF2 级分达到最高，此后逐渐向内减少。Ma 等[23]将不同品种糙米由外向内研磨得到4 层米糠粉末（L1～L4），通过分析蛋白质含量发现，蛋白质主要分布在L1～L3 中，尤其在L2 含量最高。结合图1、2 推断，糙米中硒元素富集不均匀，可能是不同级分米糠中蛋白质含量差异所导致的。

图1 不同富硒糙米米糠级分硒含量Fig.1 Selenium content in rice bran of different selenium-rich brown rice

图2 富硒糙米不同级分米糠蛋白含量Fig.2 The rice bran protein content of selenium-rich brown rice was divided into different classes

2.1.3 米糠蛋白提取及纯度

以富硒粳稻“南粳9108”（NSR）及其普通对照组为原料，提取其不同级分米糠蛋白的纯度和硒含量如表2 所示。提取的富硒蛋白组与普通蛋白组蛋白质纯度介于78.96%～82.69%，两组无显著性差异，从MR6部分提取的精米蛋白纯度则要显著高于从米糠中提取的蛋白纯度。富硒蛋白组的硒含量介于1.14%～4.40%，要远高于硒含量介于0.10%～0.47%的普通蛋白组（P＜0.05），此外，两组中由BF1～BF5 级分米糠所提蛋白的硒含量最高，此后逐渐向内降低。由于糙米中的硒元素主要以硒蛋白的形式存在[10]，因此不同级分米糠蛋白的硒含量变化和糙米米糠中硒含量（图1）变化较为一致。

表2 不同级分米糠提取蛋白纯度及硒含量Table 2 Protein purity and selenium content of selenium-rich brown rice

2.2 不同米糠级分蛋白抗氧化能力

2.2.1 DPPH·清除活性的测定

不同级分富硒和普通米糠蛋白清除DPPH·的能力如图3 所示，结果以Vc 当量表示。结果表明，普通米糠蛋白DPPH·清除率介于4.84～7.90 mg Vc/g，富硒米糠蛋白DPPH·清除率介于8.41～16.46 mg Vc/g。整体来看，富硒处理显著提高了不同级分米糠蛋白的DPPH·清除能力，在BF1、BF2、BF3 和BF4（DOM为0%～7.05%）级分的富硒米糠蛋白DPPH·清除率最高，且差异不明显（P＜0.05），此后，随着碾减率的进一步增加，DPPH·清除率逐渐降低，在MR6（DOM在11.54%后的精米部分）达到最低。不同级分普通米糠蛋白DPPH·清除率也有着相似变化。硒蛋白参与构成的谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶具有很强的自由基清除能力[24]，这些变化可能是蛋白中硒含量的差异导致的。Zeng 等[25]研究了富硒大米硒蛋白的DPPH·清除活性，发现硒协同增强了大米蛋白清除DPPH·的能力，硒含量的高低和清除能力成正比。冯明菊等[11]测定了多种富硒糙米蛋白的抗氧化活性，发现，富硒处理后的糙米蛋白具有更强的DPPH·清除能力。

图3 不同级分米糠蛋白的DPPH·清除能力Fig.3 DPPH· scavenging ability of different levels of rice bran protein

2.2.2 ABTS+·清除能力测定

如图4 所示，在0.6 mg/mL 的样品质量浓度下，不同级分富硒和普通米糠蛋白均具有一定的清除ABTS+· 能力，其 ABTS+· 清除率介于 12.66～24.56 mg Vc/g。结果表明，富硒处理能显著提高米糠蛋白的清除ABTS+·能力（P＜0.05）。正如Islam 等[26]所观察到的，硒含量与ABTS 自由基清除活动之间存在正相关。在BF3 级分米糠蛋白ABTS+·清除率最大，达到24.56 mg Vc/g，BF1、BF2、BF4 和BF5 级分米糠蛋白次之，MR6 精米蛋白抗氧化能力最差，这可能是受到精米蛋白硒载量低的影响。普通米糠蛋白也表现出相同趋势。Liu 等[27]测定富硒发芽糙米和发芽糙米蛋白质对ABTS+·的清除能力，同样发现在所有处理条件下，富硒发芽糙米蛋白的抗氧化活性均高于发芽糙米蛋白。不同级分富硒和普通米糠蛋白对ABTS+·清除能力和DPPH 清除能力的测定结果一致。

图4 不同级分米糠蛋白的ABTS+·清除能力Fig.4 ABTS+· scavenging ability of rice bran proteins at different levels

2.2.3 ·OH 清除能力的测定

不同级分富硒和普通米糠蛋白的羟自由基清除能力如图5 所示，结果以Vc 当量表示。结果表明，普通米糠蛋白·OH 清除能力介于22.65～33.66 mg Vc/g，富硒米糠蛋白·OH 清除能力介于82.10～197.13 mg Vc/g，造成这种差异的原因可能是硒蛋白和含硒的酶类物质拥有较强的·OH 清除能力[12]。在0.6 mg/mL 的样品浓度下，不同级分富硒米糠间的·OH 清除能力无显著性差异，但远高于MR6（精米）蛋白（P＜0.05），这是因为米糠蛋白硒含量显著高于精米蛋白。普通米糠蛋白组的不同级分米糠蛋白和精米蛋白都不存在显著性差异。Zeng 等[28]对富硒大米中提取的硒蛋白的抗氧化活性和清除自由基活性进行了研究，发现水溶性硒蛋白具有清除·OH 的能力，且蛋白硒含量越高，清除能力越强。本研究与上述文献结果基本一致。

图5 不同级分米糠蛋白的·OH 清除能力Fig.5 ·OH scavenging ability of rice bran proteins at different levels

2.2.4 铁离子还原能力的测定

结果如图6 所示，不同级分米糠蛋白的铁离子还原能力以Vc 当量表示。结果表明，普通米糠蛋白铁离子还原能力介于1.98～3.36 mg Vc/g，富硒米糠蛋白铁离子还原能力介于2.48～4.33 mg Vc/g，富硒处理提高了米糠蛋白的铁离子还原能力，这是因为蛋白质中的硒取代了氨基酸中的硫，主要以硒半胱氨酸的形式存在于蛋白质中，对起催化作用的金属离子具有络合作用[26]。此外，富硒和普通MR6（精米）蛋白间的铁离子还原能力则没有显著差异（P＜0.05）。在BF1、BF2、BF3 和BF4 级分米糠蛋白的铁离子还原能力最强，随着碾减率的增加，还原能力显著降低并趋于平缓，两组都表现出相同的趋势。Chen 等[16]研究了富硒花生分离蛋白的抗氧化能力，发现所有样品都表现出良好的还原能力，且还原能力变化趋势与Se 含量分布趋势相似，说明Se含量与抗氧化活性有关。

图6 不同级分米糠蛋白的铁离子还原能力Fig.6 Iron reduction capacity of rice bran proteins at different levels

2.3 α-淀粉酶抑制活性的测定

如图7 所示，在1.2 mg/mL 的样品质量浓度下，不同级分富硒和普通米糠蛋白均具有一定的α-淀粉酶抑制能力，其抑制率介于17.16%～21.22%。0.6 mg/mL阿卡波糖的抑制率则达到了37.84%，要远高于米糠蛋白。有研究表明，α-淀粉酶抑制剂主要通过特异性地与α-淀粉酶形成抑制复合物来阻断淀粉的分解和吸收[29]。糙米蛋白对α-淀粉酶抑制作用尚未明确，还有待研究。整体来说，富硒处理提高了BF1、BF2、BF3和BF4 级分米糠蛋白的α-淀粉酶抑制能力，这可能是富硒处理改变了米糠蛋白的化学结构，使其生物活性提高所致[30]。但对BF5 级分米糠蛋白以及MR6 精米蛋白没有影响。此外，米糠蛋白的α-淀粉酶抑制能力要强于精米蛋白。

图7 不同级分米糠蛋白的α-淀粉酶抑制能力Fig.7 α-Amylase inhibition of rice bran proteins at different levels

2.4 相关性分析

不同级分米糠及其蛋白硒含量和蛋白质纯度与功能特性指标的相关性见表3。其米糠硒含量和蛋白质硒含量与DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力和·OH 清除能力均呈极显著正相关（P＜0.01），与铁离子还原能力和α-淀粉酶抑制能力呈显著正相关（P＜0.05）。这种差异性可能与硒蛋白的作用成分以及作用机制的不同所导致[31]。从不同级分米糠中提取的蛋白质纯度则与DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、·OH 清除能力、铁离子还原能力和α-淀粉酶抑制能力均呈负相关但不显著（P＞0.05）。这说明本研究中不同级分米糠蛋白质的纯度差异，并不会对实验结果造成影响。结果表明，蛋白中硒含量的高低直接反应了其抗氧化能力和α-淀粉酶抑制能力，硒蛋白是糙米不同级分米糠中重要的抗氧化物质。

表3 不同级分米糠及其蛋白硒含量和蛋白纯度与功能特性指标的相关性Table 3 Correlation between selenium content and protein purity of rice bran at different levels and functional property indexes

3 结论

本研究对富硒粳稻“南粳9108”（NR），富硒籼稻“巨2 优60”（JR）、“野香优航1573”（YR）及其普通对照组的不同米糠级分及蛋白的硒元素分布和相关抗氧化性指标、α-淀粉酶抑制能力进行了研究。结果表明，硒元素在糙米中的分布并不均匀，在BF3（DOM为6.68%～7.05%）处含量最丰富，此后随着碾减率的增加而逐步下降，精米的硒含量最低。富硒处理后，糙米的粗蛋白含量有所增加，不同级分米糠蛋白尤其是BF1、BF2、BF3 和BF4 级分富硒米糠蛋白显示出更强的抗氧化性和α-淀粉酶抑制能力，此外，不同级分米糠蛋白的抗氧化性和α-淀粉酶抑制能力均要优于精米蛋白。相关性分析显示，糙米蛋白中硒含量的高低直接反应了其抗氧化能力和α-淀粉酶抑制能力，糙米外层的米糠是硒元素的良好来源，具有有效的生物活性，硒蛋白是糙米不同级分米糠中重要的抗氧化物质。本研究为富硒糙米的适度加工及其米糠的综合利用提供了理论参考。