自制鼻咽解毒胶囊含药血清对鼻咽癌细胞系5-8F存活、凋亡的影响及其机制

韩蜜，龙远雄

1 湖南省肿瘤医院药学部，长沙 410013；2 湖南中医药大学第一附属医院科研部

鼻咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤［1-2］，与EB 病毒感染有关，EB 病毒在人群中的感染阳性率高达90%以上［3］。目前，临床治疗鼻咽癌的方法主要为放疗、化疗、同步放化疗等［4］，但放化疗也存在弊端，如敏感性降低、放化疗后的不良反应大等。鼻咽解毒胶囊以往称连芩解毒方，其制剂名称为鼻咽解毒胶囊，是湖南中医药大学第一附属医院的自制制剂，由黄连、黄芩、黄芪、甘草、白花蛇舌草五种中药制成，具有清热解毒、扶正培本之功效［5］。现代实验室研究表明，黄连素能够通过mTOR、MAPK 等靶点和信号通路共同作用于鼻咽癌［6］。黄芩苷能抑制鼻咽癌CNE-2 细胞的增殖，并通过TGF-β1/ERK1/2 信号通路的抑制作用PCNA、Survivin 的表达［7］。张树聪等［8］发现，黄芪中的黄芪多糖能通过抑制上皮间质转化（EMT）和Akt/ERK 信号通路抑制CNE-1 细胞的迁移和侵袭。文献［9］报道，白花蛇舌草多糖对鼻咽癌裸鼠肿瘤有抑制作用。王晓晖［10］认为，甘草中的甘草甜素可通过同源框基因D 簇反义RNA1 和微小RNA-30a-3p 对鼻咽癌细胞产生影响。课题组前期围绕本方的制剂开发、质量控制，抗菌、抗炎、免疫调节、鼻咽癌防治等进行了研究［11-13］。本研究在前期的研究基础上，对鼻咽解毒胶囊方药中的药效成分与鼻咽癌进行了网络药理学研究，发现其活性成分通过PI3K-Akt、MAPK 等信号通路调控鼻咽癌细胞并发挥治疗作用［14］。5-8F 细胞是鼻咽低分化鳞状细胞癌细胞系SUNE-1 亚株，为人高转移鼻咽癌细胞系，来自鼻咽癌患者，进行鼻咽癌研究时多选择高转移细胞株［15］。2022 年6—12 月，我们观察了鼻咽解毒胶囊对5-8F 细胞存活、凋亡的影响，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂、仪器 人鼻咽癌5-8F 细胞珠购自于赛百慷（上海），由本实验室传代培养。胎牛血清（Gibco，批号10099141），RPMI 1640 培养基（Sigma，批号R8758），胰酶消化液（abiowell，批号AWC0232），双抗（青链霉素）（碧云天，批号SV30010），CCK-8（abiowell，批号AWC0114a），细胞冻存液（abiowell，批号AWC0229），Annexin V-APC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基，批号KGA1030-1007），BCA 蛋白定量试剂盒（中国Abiowell，批号AWB0104），广谱彩虹预染蛋白Marker（Abiowell，批号AWB0236），Tris-HCl 缓冲液（中国Abiowell，批号AWB0073），Western 转膜缓冲液（中国Abiowell，批号AWB0211），蛋白酶抑制剂混合液（AWB0005，批号AWB0005），DNA 凝胶加样缓冲液（中国Abiowell，批号AWR0103），mRNA 逆转录试剂盒（中国北京康为世纪，批号CW2569），UltraSYBR Mixture（中国北京康为世纪，批号CW2601），DM2000 Plus DNA Marker（中国北京康为世纪，批号CW0632）。DH-160I 直热式二氧化碳培养箱（上海三藤仪器），SL02 低速离心机（知信仪器），MB-530多功能酶标分析仪（汇松），H1650R 台式冷冻离心机（中国湖南湘仪），BioPrep-24 生物样品均质仪（生物样品均质仪），ChemiScope6100 化学发光成像系统（中国勤翔），荧光定量RCP 仪（美国Thermo），DYY-2C 电泳仪（中国北京六一），DYCP-31DN 水平琼脂糖电泳槽（中国北京六一）。

1.2 鼻咽解毒胶囊供试品、含药血清制备 鼻咽解毒胶囊供试品：取鼻咽解毒胶囊内容物适量，加入蒸馏水配制成浓度为2 g/mL［5］。鼻咽解毒胶囊含药血清：将20只SD大鼠（雌雄各半，体质量为180～220 g）随机分成空白组和给药组，每组10只。给药组给予15.309 g/kg 的鼻咽解毒胶囊灌胃，空白组按大鼠体重给予等体积的0.9%生理盐水灌胃，大鼠每日灌胃2 次，连续给药7 d，并于末次灌胃后1 h 给予深度麻醉，抽取下腹主动脉血5 mL，室温静置1～2 h，以2 000 r/min的速度离心15 min，取血清，将同组血清进行混合，用0.22 μm 微孔滤膜滤过除菌，-80 ℃保存备用。

1.3 5-8F 细胞培养 从液氮罐中取出5-8F 细胞经过37 ℃水浴快速解冻，10% FBS + 1%双抗的RPMI 1640 培养基培养，37 ℃环境下，5%CO2饱和湿度培养箱中按1∶3 比例进行传代，再次液氮罐中冻存，显微镜下计数等流程完成细胞培养，取对数生长期的细胞用于实验。

1.4 5-8F 细胞分组、鼻咽解毒胶囊含药血清干预及细胞存活率测算 采用CCK-8 法。取经“1.3”培养的对数生长期5-8F 细胞，并分为8 组，5%、10%、15%、20%、25%、30% 含药血清组分别加入5%、10%、15%、20%、25%、30%的鼻咽解毒胶囊含药血清，20%空白血清组加入20%不含药物血清，对照组为细胞正常培养，不加血清。以每孔含5×103个5-8F 细胞的悬液，种于96 孔板内，各组均设3 复孔。于37 ℃、5%CO2条件中培养，培养贴壁后弃原培养基，加入以上分组的培养基。于24、48 h 后，弃原培养液，每孔加入含有CCK-8 的培养基100 μL，以5%CO2继续孵育4 h，无细胞的RPMI 1640 培养液空白孔调零，选择450 nm 波长处用酶标仪检测吸光度（OD）值，根据酶标仪的检测结果计算不同组分细胞存活率，细胞存活率=［（实验组OD 值—Black 组OD值）/（对照组OD值—Black组OD值）］×100%。不含细胞的RPMI 1640 培养基组为Black 组，用于调零；将不同浓度的含药血清组和20%空白血清组设为实验组。

1.5 5-8F 细胞分组、鼻咽解毒胶囊含药血清干预及细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。细胞培养同上，取对数生长期5-8F 细胞，以1×105个/皿的密度铺板在中皿里，待细胞贴壁后进行分组处理，阴性组细胞正常培养24 h，低剂量组加入5%含药血清处理24 h，中剂量组加入20%含药血清处理24 h，高剂量组加入30%含药血清处理24 h。以上处理的细胞用胰酶消化收集，用PBS 洗涤3 次，每次以2 000 r/min速度离心5 min，收集细胞，依次加入500 μL的Binding buffer 悬浮细胞、Annexin V-APC、LPropidium Iodide，充分混匀，室温条件下避光反应10 min。在1 h内上流式细胞仪检测，该实验每个样本重复3次，取平均值。

1.6 5-8F 细胞分组、鼻咽解毒胶囊含药血清干预及细胞K-RAS、RAF mRNA 相对表达量测算 采用RT-qPCR 法。细胞培养同上，取对数生长期5-8F 细胞，以1×105个/皿的密度铺板在中皿里，待细胞贴壁后进行分组处理，对照组细胞正常培养24 h，低剂量组加入5%含药血清处理24 h，中剂量组加入20%含药血清处理24 h，高剂量组加入30%含药血清处理24 h；向保存在培养皿中的5-8F细胞加入TRIzol，吹打混匀后移至离心管，室温条件下裂解，加入三氯甲烷，振荡，离心。取上层液相，转移到新的RNase-Free离心管中，加入异丙醇溶液，离心，弃上清，加入乙醇用以洗涤及沉淀，离心，弃上清。加入无酶水溶解沉淀，于260 nm 与280 nm 波长处用紫外分光光度计测定OD260、OD280，根据两个值的比值计算其浓度跟纯度，按试剂盒说明书将 RNA 反转录合成 cDNA。PCR反应条件：95 ℃条件下10 min→95 ℃条件下15 s→60 ℃条件下30 s为一次循环，共40个循环。以GAPDH为内参，引物由北京擎科生物科技股份有限公司提供，引物分别为K-RAS（5'-ACAGCCTCAAGATCATCAGC-3'，5'-GGTCATGAGTCCTTCCACGAT-3'，149 bp）、RAF（5'-TCACGCTGGAGTGGTTCT-3'，5'-CAATACGATGCCATAGGAGT-3'，135 bp）、GAPDH（5'-ACA GCCTCAAGATCATCAGC-3'，5'-GGTCATGAGTCCT TCCACGAT-3'，104 bp）。通过2-ΔΔCt反映各样品相对于对照组样品目的基因表达水平的比值。

1.7 5-8F 细胞分组、鼻咽解毒胶囊含药血清干预及细胞K-RAS、RAF、MEK、p-ERK1/2 蛋白相对表达量测算 采用Western blot 法。细胞培养同上，取对数生长期5-8F 细胞，以1×105个/皿的密度铺板在中皿里，待细胞贴壁后进行分组处理，对照组细胞正常培养24 h，低剂量组加入5%含药血清处理24 h，中剂量组加入20%含药血清处理24 h，高剂量组加入30%含药血清处理24 h；5-8F 细胞经不同组药物处理24 h 后，用预冷PBS 洗涤细胞，加入RIPA 裂解液裂解细胞，超声破碎，离心，配置BCA 工作液测定蛋白浓度，设定75 V 电泳观察溴酚蓝电泳至胶底部时，转膜，用脱脂奶粉配制5%封闭液，封闭，育一抗二抗，凝胶成像系统成像，并分析各蛋白条带的相对灰度值。

1.8 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以xˉ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较方差齐性用LSD法检验，若方差不齐采用Dunnet T3 法检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时点细胞存活率比较 不同时点细胞存活率比较见表1。

表1 各组不同时点细胞存活率比较（%，± s）

表1 各组不同时点细胞存活率比较（%，± s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与20%空白血清组比较，#P<0.05；与同组24 h比较，△P<0.05。

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2.2 各组细胞凋亡率比较 低剂量组、中剂量组、高剂量组、阴性组细胞凋亡率分别为5.63% ± 0.26%、8.83% ± 0.14%、15.08% ± 0.33%、0.60% ± 0.11%，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别与阴性组比较，低、中、高剂量组两两比较，P均<0.05。

2.3 各组细胞K-RAS、RAF mRNA 相对表达量比较 细胞K-RAS、RAF mRNA相对表达量比较见表2。

表2 各组细胞K-RAS、RAF mRNA相对表达量比较（± s）

表2 各组细胞K-RAS、RAF mRNA相对表达量比较（± s）

注：与阴性组比较，*P<0.05；与低剂量组比较，#P<0.05；与中剂量组比较，△P<0.05。

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2.4 各组细胞K-RAS、RAF、MEK、p-ERK1/2 蛋白相对表达量比较 细胞K-RAS、RAF、MEK、p-ERK1/2蛋白相对表达量比较见表3。

表3 各组细胞K-RAS、RAF、MEK、p-ERK1/2蛋白相对表达量比较（± s）

表3 各组细胞K-RAS、RAF、MEK、p-ERK1/2蛋白相对表达量比较（± s）

注：与阴性组比较，*P<0.05；与低剂量组比较，#P<0.05；与中剂量组比较，△P<0.05。

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3 讨论

鼻咽癌是起源于黏膜上皮的恶性肿瘤，解剖部位特殊［16］，呈浸润生长，早期病灶小，症状不典型，易发生颈部淋巴结甚至远处转移［17-18］。临床上针对鼻咽癌的治疗主要采用放射疗法，而对于中晚期、复发性及转移性鼻咽癌，则采用诱导化疗加同期放化疗［19］。鼻咽癌患者治疗后易复发，如何减轻放化疗的不良反应及降低复发率是目前临床上亟需解决的问题。中医药是在辩证论治原则的指导之下，对疾病进行多角度、多层次、多方面的分析，最终达到祛病的目的。中医在临床中多采用复方的形式存在，根据疾病的证候与药物的特性，以“君臣佐使”的方式让药物发挥最大的协同疗效，传统中药治疗鼻咽癌的同时，可减轻放化疗的不良反应，调节患者气虚体质，起到增效减毒的作用。中药相对于西药来说成分复杂［20］，而肿瘤的生长也是一个多阶段复杂的过程，研究鼻咽癌的分子机制，为鼻咽癌的治疗扩展领域成了鼻咽癌防治的关键所在。许多中药和单体化合物，如黄酮类、生物碱和苯丙烷类等都具有显著的抗肿瘤作用［21-22］。中药具有多组分、多靶点的特点，不仅可以抗肿瘤，还可以减少放化疗的毒副作用。此外，在肿瘤防治方面，特别是在增强宿主免疫功能和延长患者生存期方面也显示出独特的优势［23］。鼻咽解毒胶囊具有清热解毒、扶正培本之功效，主要用于鼻炎、咽炎和EB 病毒阳性的鼻咽癌高危人群抗病毒治疗，在湖南中医药大学第一附属医院临床应用30 余年，治疗鼻咽、咽炎疗效显著，在治疗鼻咽癌方面，课题组前期已完成鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌的网络药理学和分子对接研究，初步证实鼻咽解毒胶囊能抑制鼻咽癌细胞的生长或促进其凋亡的生物有效性。

MAPK 信号通路是一个级联磷酸化的过程，核心成员包括MAPKKK、MAPKK、MAPK［24］。RAS 蛋白是广泛表达的膜结合小GTP 酶，其活性形式将与RAF 原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结合［25］，RAS是RAS-MAPK 信号通路中的第一个细胞内效应子，是将信号从细胞表面受体蛋白传递到细胞内效应器所介导的物质，调节包括细胞生长、分化等许多细胞过程［26-27］。K-RAS 是RAS 家族中最常见的亚型，通常与疾病侵袭性、预后不良和对治疗反应差有关［28-29］。RAF 蛋白容易被RAS 激活，具有更高的基础激酶活性。MAPK 家族中研究最为广泛的是ERK1/ERK2 激酶，在正常细胞中，酪氨酸激酶受体通过其特异性配体激活，通过MAP 激酶途径诱导ERK 的磷酸化和核易位，ERK 则是诱导细胞增殖和存活基因的转录因子［30］。MEK1/2 作为易突变蛋白RAS、RAF 的下游蛋白，也可以作为一个靶点［31-32］。MAPK/ERK1/2 信号通路在鼻咽癌细胞中被高度激活，抑制该通路可诱导鼻咽癌细胞凋亡。

本文通过体外实验研究鼻咽解毒胶囊干预鼻咽癌5-8F 细胞的作用，能不同程度地影响细胞的存活率。CCK-8检测提示一定浓度的鼻咽解毒胶囊能降低癌细胞存活率，抑制其生长。流式细胞术结果显示，与阴性组比较，鼻咽解毒胶囊含药血清组的细胞凋亡率显著升高。RT-qPCR 法结果显示，与阴性组比较，鼻咽解毒胶囊低、中、高剂量组鼻咽癌细胞中K-RAS、RAF mRNA 相对表达量均显著低于阴性组。Western blot 检测经过不同浓度鼻咽解毒胶囊处理24 h 后，MAPK/ERK 信号通路相关蛋白RAF，KRAS、p-ERK1/2 表达下调。说明鼻咽解毒胶囊可以通过抑制MAPK/ERK 信号通路的传导，从而促进5-8F细胞凋亡。

总之，鼻咽解毒胶囊含药血清能抑制5-8F 细胞存活，并促进细胞凋亡，且呈剂量依赖性，尤以30%鼻咽解毒胶囊含药血清剂量为最佳，机制可能与其可抑制MAPK/ERK信号通路有关。