急性淋巴细胞白血病患者外周血滤泡辅助性T细胞亚群比例、血清细胞因子水平变化及其相关性

张冉冉，龚珊，张瑞，张淋一，张曼姁，曲建华

新疆医科大学第一附属医院血液病中心，乌鲁木齐 830054

急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种发生在B细胞或者T 细胞的未成熟淋巴细胞的肿瘤性疾病，主要病理表现为大量原始细胞聚集在骨髓内，破坏骨髓正常的造血，而产生一系列的症状，包括贫血、出血、感染等［1］。在标准化疗过程中，ALL 容易产生耐药性和复发，复发后的治疗会引起各种并发症，导致患者的存活率显著降低，使治疗充满挑战，寻找新的、不良反应少、患者能耐受的治疗方法是目前临床上亟待解决的关键问题［2］。T 淋巴细胞亚群在体液免疫和细胞免疫方面发挥重要作用，其亚群比例平衡偏移可能导致免疫监视功能异常，进而促进肿瘤细胞的生长增殖［3］。研究［4］发现，接受免疫化疗的ALL 患者出现辅助性T 细胞1 型（Th1）数量升高、辅助性T 细胞2 型（Th2）及调节性T 细胞（Treg）数量减低，提示免疫化疗治疗影响ALL 患者T 细胞，尤其是CD4+T 细胞，可能导致机体免疫功能障碍。Tfh1 分泌Th1 型细胞因子干扰素-γ（IFNγ），Tfh2 分泌Th2 型细胞因子IL-γ，Tfh17 分泌Th17细胞因子IL-17。目前，关于ALL 患者Tfh 亚群及细胞因子之间的作用关系尚不明确，国内鲜有相关报道［5-10］。2022 年5 月—2023 年6 月，我们观察了ALL外周血Tfh 亚群比例、血清细胞因子水平变化，并分析两者间及其与患者预后的关系，旨在为ALL 的免疫治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2022 年5 月—2023 年6 月新疆医科大学第一附属医院收治的初次确诊未经治疗的ALL 患者30 例（观察组），男18 例，女12 例；中位年龄43.00（21.75，58.00）岁；所有患者均经细胞形态学、免疫学、细胞遗传学及分子生物学分型明确诊断，排除慢性淋巴细胞白血病的急淋变及既往有相关自身免疫性疾病、感染、肿瘤病史的患者，符合《血液病诊断及疗效标准》的诊断标准。观察组再根据ALL 患者预后危险分层标准［11］分为预后良好者［13例，年龄<35 岁，初诊WBC<30×109/L（B-ALL）或<100×109/L（T-ALL），早期达完全缓解（CR）且CR 后MRD 阴性/<10-4］和预后不良者［17 例，年龄≥35岁，初诊WBC≥30×109/L（B-ALL）或≥100×109/L（T-ALL），达CR 时间超过4周且CR 后MRD 阳性/≥10-4］。另选取同期健康体检者20 例（对照组），男10 例，女10 例；中位年龄48.5（37.75，58.00）岁。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。本研究获得新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（批准文号：K202306-11），受试者均知情同意。

1.2 外周血Tfh 比例、血清细胞因子测算 分别采集观察组和对照组空腹外周静脉血4 mL，置于肝素钠抗凝试管中，颠倒混匀后静置，于2 h 内送检。采集好的外周血经室温150 g 离心5 min，收集上层血清，立即冻存于-80 ℃冰箱，备用。①外周血Tfh 亚群：采用流式细胞术检测。取存有4 mL 新鲜外周血的 肝素钠抗凝管，标记所有受试者序号，在流式管壁上标记相对应序号，准备需要的抗体。吸取100 μL 外周血置于相同编号的流式管内，分别加入抗体CD4-FITC、CXCR3-PE/Dazzle、CCR6-PerCP/Cyanine5.5、CXCR5-PE 各1 μL，在避光环境下温育20 min；后加入1 mL 溶血剂混匀，在避光环境下静置20 min；随后经150 g 下离心5 min，倒去上清；加入2 mL 的PBS 溶液混匀，经150 g 下离心5 min，随后加入PBS 溶液300 μL 混匀重悬细胞，然后上流式细胞仪检测Tfh（CD4+CXCR5+）、Tfh1（CD4+CXCR5+CXCR3+CCR6-）、Tfh2（CD4+CXCR5+CXCR3-CCR6-）及Tfh7（CD4+CXCR5+CXCR3-CCR6+） 的细胞比例，获取数据后，应用FlowJo软件分析。②血清IFN-γ、IL-4、IL-17：采用ELISA法检测。将血清标本放置室温解冻，同时将Human IFN-γ、IL-4、IL-17的ELISA 试剂盒提前放至室温平衡20 min；在酶标包被板上设标准品孔，加入不同稀释浓度的标准品50 μL，并设空白孔及待测孔；在待测孔中加待测样品40 μL，再加抗IFN-γ、IL-4、IL-17抗体各10 μL，晃动混匀，每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外；再加入100 μL 过氧化物酶工作液，封板，37 ℃孵育1 h，弃去液体并甩干，洗板5 次，每孔加入100 μL 的底物溶液，37 ℃孵育15 min，50 μL 终止溶液终止反应，检测每孔450 nm 吸光度，根据测得的标准品浓度以及对应的OD 值绘制标准曲线，计算出血清IFN-γ、IL-4、IL-17。

1.3 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以xˉ ± s 表示，比较采用t检验；相关性分析采用Pearson 相关分析法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血Tfh 亚群比例比较 外周血Tfh 亚群比例比较见表1。

表1 两组外周血Tfh亚群比例比较（%，± s）

表1 两组外周血Tfh亚群比例比较（%，± s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与预后不良者比较，bP<0.05。

?

2.2 两组血清IFN-γ、IL-4、IL-17 水平比较 血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平比较见表2。

表2 两组血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平比较（ng/L，± s）

表2 两组血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平比较（ng/L，± s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与预后不良者比较，bP<0.05。

?

2.3 观察组外周血Tfh 亚群比例与血清细胞因子的相关性 观察组Tfh、Tfh2 比例与ALL 患者血清IL-4 水平呈正相关（r分别为0.860、0.965，P均<0.05），Tfh 比例与血清IFN-γ 水平呈负相关（r为-0.289，P<0.05）。

3 讨论

ALL 是一种恶性造血系统肿瘤，其能够浸润到骨髓、血液或其他器官和组织中，引起骨髓造血功能障碍和免疫功能障碍。ALL起病急，发展迅速，具有很高的异质性，因其发病机制及病因的复杂性，患者预后较差，平均生存期仅3 个月［12-13］。现阶段AL 的主要治疗包括化学治疗及造血干细胞移植等方法，尽管随着化疗方案的优化及造血干细胞移植技术的提升，在一定程度上ALL 患者的缓解率及生存时间有所延长，但是仍有部分的患者因疾病复发或难治而死亡［14］。近年来，不断研究和发展的免疫疗法成为一种具有潜力治疗手段，可提高ALL 的精准靶向诊疗。

随着对ALL 疾病不断深入研究，已证实免疫功能紊乱与ALL 的发病机制有关。在抗肿瘤免疫中，淋巴细胞具有重要的作用，T 细胞亚群之间通过相互协调、相互拮抗来维持免疫应答的相对平衡，研究发现的 T 细胞亚群的失调和平衡紊乱参与了ALL疾病进展［3-4，15］。这些年，在免疫学领域，新发现的CD4+T细胞亚群Tfh细胞越来越受到重视，它搭起人体的细胞免疫和体液免疫的桥梁作用［16］。Tfh 细胞是一种不同于Th1、Th2 和Treg 细胞的CD4+T 细胞新亚群，主要定位于B 淋巴滤泡，辅助初始B 细胞增殖分化成熟、抗体类别转换及分泌，促进生发中心形成。已有研究［17］表明，B细胞淋巴瘤患者Tfh细胞数量增多，过度活化的Tfh 细胞，通过分泌如肿瘤坏死因子α、IL-4 及IL-21 等细胞因子可能改变肿瘤微环境，促进肿瘤细胞逃逸。最近的一项研究表明，CLL患者Tfh 细胞的增加与临床分期和肿瘤负荷有关，提示Tfh 在CLL 发病机制中起重要作用，特别是Tfh1细胞水平升高，与肿瘤负荷相关性更强，进而参与了疾病的进展［18］。ZHOU 等［10］研究学者报道，初诊治疗前ALL 患者外周血中Tfh 细胞水平明显高于健康对照组，而在诱导化疗2、4、6个疗程后，缓解者Tfh 水平呈下降趋势，至第6 个疗程末，接近甚至低于健康人，这提示Tfh 过度活化与ALL 疾病进展密切相关。本研究发现，与对照组比较，观察组外周血Tfh 和Tfh2 比例明显增加，Tfh1 比例降低，这表明ALL患者存在免疫功能紊乱，Tfh亚群的变化可能与疾病的发病有关。本研究还显示，观察组预后不良者较良好者Tfh、Tfh2 比例明显增高，而Tfh1 比例无明显差异。提示Tfh 表达量随着ALL 患者危险度进展不断升高，患者体内存在Tfh2 比例升高，Tfh1 比例降低，导致Tfh1/Tfh2比例失衡，且平衡偏向Tfh2，这表明Tfh 可能增强免疫抑制作用，特别是Tfh2 发挥主导作用，促进了疾病的进展。

细胞因子的失衡有助于抑制免疫应答，对于逃避免疫监视至关重要。IFN-γ 是一种主要由T 细胞和自然杀伤细胞产生调节和效应细胞因子，在肿瘤微环境中，其是肿瘤免疫监测的重要参与者，包括抗增殖、抗血管生成和促凋亡等作用［19］。IL-4 是一种多效性的细胞因子，对B 细胞的活化、增殖、分化等不同阶段都发挥重要的作用，其可以下调Th1细胞，抑制抗肿瘤免疫反应。低水平的IFN-γ 可以活化自然杀伤细胞的活化和细胞毒性T 淋巴细胞，降低肿瘤抗原的识别能力，诱导肿瘤细胞发生逃避，还能作用于CD8+T细胞，减弱其对肿瘤细胞的毒性，增加抑制免疫细胞的产生［20］。杨志刚等［4］学者检测了初诊急性白血病患者中血清中IFN-γ 和IL-4，发现ALL患者血清IL-4 水平升高，IFN-γ 水平降低，并检测到ALL 患者机体存在Th1/Th2 比例失衡，使免疫微环境处于抑制状态，不利于抗肿瘤免疫反应，从而导致白血病细胞逃逸。本研究同样检测观察组血清中IFN-γ 和IL-4 水平，并得出了一致的结论；在不同预后分层者中，还发现在预后不良者血清中IL-4 水平更高和IFN-γ 水平更低。故推测在ALL 疾病恶性进展过程中，大量炎症细胞及免疫细胞被活化，高水平的IL-4 和低水平的IFN-γ 导致ALL 患者免疫微环境紊乱，使CD4+Th 细胞向Tfh 分化、增殖。而Tfh 数量的增多，使机体免疫功能发生改变，可能诱导疾病的发生。为了进一步研究ALL 疾病进展中免疫与炎症因素的关系，我们分析了ALL患者血清IFN-γ、IL-4与Tfh 亚群的相关性，结果显示Tfh、Tfh2 与ALL 患者血清IL-4 呈正相关，且与Tfh2 的相关性更强，Tfh与血清中IFN-γ水平呈负相关。我们发现，血清IL-4水平升高与外周血的Tfh2 密切相关，推测IL-4 由Tfh2 产生，而IFN-γ 与Tfh1 没有相关性，推测IFN-γ细胞因子不仅来自Tfh1，还可能来自其他免疫细胞，如Th1细胞。提示ALL 患者体内高水平IL-4和低水平IFN-γ，导致Tfh1/Tfh2免疫平衡发生变化，增多的Tfh2 通过分泌大量IL-4，抑制IFN-γ 的产生及Tfh1的活化，进而导致机体抗肿瘤免疫反应下调，促进肿瘤细胞发生免疫逃逸。

总之，ALL 患者外周血Tfh 及Tfh2 比例增加和Tfh1 比例减小，血清IFN-γ 水平降低和IL-4 水平升高，其与患者预后不良有一定的关系，可能参与了ALL的免疫功能紊乱，并且增强了免疫抑制作用，参与了疾病进展。