羊三联灭活疫苗对妊娠母羊安全性及羔羊被动免疫效果评价

白帆，王娜，宋越，张帆，张月梅，曹晓东，钱林娜，戴伶俐*

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031； 2.内蒙古医科大学药学院新药安全评价研究中心，内蒙古 呼和浩特 010020）

随着肉羊产业的快速发展，集约化、规模化程度不断提高，羊混合病原感染引起的传染性胸膜肺炎（俗称烂肺病）成为养羊生产的重大疾患问题，造成的损失巨大。绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, M.ovi)是引起绵羊、山羊、大角羊和野生小反刍动物慢性肺炎的主要病原，引起患病羊只进行性消瘦、痉挛性咳及喘等症状，病程可持续数月至数年[1-2]。本团队从内蒙古的多个地区分离到该病原，该病在规模化养殖场的发病率为14.3%～75%（引进品种羔羊）。羊多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）A/D 型常与支原体混合感染或冷、热应激后继发性感染，引起羊常见的细菌性呼吸道传染病，导致羊只出现严重的纤维素性肺炎和其他肺脏病变，危害性不断增大[3]。近年来，随着养羊业生产方式的转变，一些地区的绵羊、羔羊和育肥青年羊有地方性群发的报道，发病率为31%～87.5%，病死率为18.6%～41%，成年羊也常有散发[4]。本团队在2016—2022 年从内蒙古、辽宁、山东、陕西及宁夏等地采集777 份鼻拭子样本，检测M.ovi、PmA 及PmD 的感染情况，其中M.ovi 阳性245 份，阳性率为31.53%；PmA阳性223 份，阳性率为28.70%，PmD 阳性210 份，阳性率为27.03%；巴氏杆菌和M.ovi 混合感染阳性样本138 份，阳性率为17.76%。

虽然，国内现有针对山羊传染性胸膜肺炎的支原体双价灭活疫苗，但是对于山羊、绵羊预防效果并不理想（据不完全统计，这些疫苗对羊传染性肺炎的保护率在75%以下）[5]。试验研究和诊治实践表明，单一种类疫苗的针对性差，产生的免疫抗体对混合感染病原毒株抗原的中和覆盖度低是问题产生的主要原因和关键根源[6-7]。该项目开展了M.ovi、Pm（A/D 型）联合灭活疫苗的研究，通过对地方羊场优势流行菌株的分离和候苗株的筛选，实验室尝试研制出针对绵羊烂肺病的复方油佐剂自家灭活疫苗，攻毒保护率可达86.2%。为考查该疫苗对妊娠期母羊免疫接种的安全性，以及进一步确定新生羔羊通过初乳获得母源抗体的水平，以高繁湖羊怀孕母羊及其新生羔羊为研究对象。

1 试验材料

1.1 试验动物

已怀孕120 d 的纯种湖羊购自巴彦淖尔市五原县金草原生态科技集团有限公司，6 月内未免疫山羊支原体肺炎双价疫苗（四川海大生物出品），ELISA 检测M.ovi、Pm 血清抗体呈阴性，PCR 检测鼻拭子无M.ovi、Pm（A/D 型）等感染。

1.2 试验疫苗及试剂

绵羊肺炎支原体-多杀性巴氏杆菌A/D 型三联灭活疫苗由本实验室试制；支原体基础培养基、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基购自广东环凯微生物科技有限公司（HKM，广东）；脱脂乳、特级马血清购自北京索莱宝科技有限公司（Solarbio，北京）；BCA 蛋白定量试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司（TIANGEN，北京）；ELISA 板、HRP 标记兔抗绵羊IgG（H+L）购自生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech，上海）；其他未注明试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 仪器与设备

酶标仪购自Bio-Rad 公司。

1.4 数据统计

使用GraphPad Prism 5 统计学软件对数据进行统计及差异性分析。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

2 试验方法

2.1 妊娠后期母羊疫苗接种安全性评价

如表1 所示，试验将15 只怀孕母羊随机分为3组，分别为连续免疫单一剂量试验组、超剂量免疫试验组及PBS 对照组，每组5 只。其中，连续免疫单一剂量试验组羊只疫苗免疫剂量为5 mL/只，共免疫4 次，每次免疫时间间隔7 d； 超剂量免疫试验组羊只疫苗免疫剂量为10 mL/只，共免疫1 次；PBS 对照组羊只免疫PBS 作为对照，免疫剂量为5 mL/只。采用颈部皮下注射方式，免疫后及产羔前后统计流产率、弱羔率、早产2 周龄羔羊存活率及致畸率等情况。

表1 疫苗安全性评价分组方式

2.2 新生羔羊母源抗体获得水平及妊娠母羊抗体评价

2.2.1 妊娠羊免疫设计。试验将20 只怀孕母羊随机分为2 组，分别为免疫试验组及PBS 对照组，每组10只。免疫剂量为5 mL（表2），采取颈部皮下注射。母羊分别在免疫前、免疫后14 d 及28 d 采血。羔羊出生后24 h 内保证及时摄入足量初乳。同时在羔羊出生后第1、3、6、9、12 及15 天分别采血，分离血清后于-20 ℃保存备用。

表2 妊娠母羊免疫分组方式

2.2.2 抗体评价。M.ovi 及Pm 分别利用加有10%马血清的支原体培养基及TSB 培养基培养至对数生长期，分别取适量培养液12 000 r/min 离心30 min 后弃上清，用等量PBS 溶液重悬沉淀，以上步骤重复3次后将菌体沉淀重悬，0 ℃冰浴条件下利用超声破碎仪破碎菌体，释放菌体蛋白。使用BCA 蛋白定量试剂盒对菌体总蛋白进行定量后，利用碳酸盐包被液稀释菌体蛋白至0.5 μg/孔后包被ELISA 板，取200 μL 浓度为50 g/L 的脱脂乳37 ℃封闭2 h 后用PBST 洗3次。进行M.ovi 或Pm 抗体检测的羊血清分别以体积比为1∶100 和1∶200 稀释，并按100 μL/孔分别加入上述ELISA 板中，37 ℃孵育90 min，PBST 洗3 次。每孔加入100 μL 按体积比1∶10 000 稀释的兔抗绵羊HRP-IgG，37 ℃孵育1 h，PBST 洗3 次。利用TMB 底物溶液显色25 min 后，取2 mol/L 硫酸100 μL/孔终止显色，并分别测量其OD450。

2.3 新生羔羊获得母源抗体被动免疫效果评价

新生羔羊在出生60 d 后，每组随机抽选3 只进行剖检，观察呼吸系统病变情况，并依据肺脏病变评分标准进行评测。羊只肺脏分为7 叶，每叶肺脏根据病变面积不同进行相应打分，0%～25%面积病变评为1 分；25%～50%面积病变评为2 分；50%～75%面积病变评为3 分；75%～100%面积病变评为4 分； 满分为28 分。

3 试验结果

3.1 妊娠后期母羊疫苗接种安全性评价

为进行妊娠后期母羊疫苗接种安全性评价，本试验对3 组怀孕母羊在完成免疫后分别统计流产率、弱羔率、早产2 周龄羔羊存活率及致畸率情况。试验观察至怀孕母羊产羔后第60 天。如表3 所示，3 组试验妊娠羊只均未发生流产及早产2 周情况，分娩羔羊均健康成活，没有弱羔及致畸现象。

表3 疫苗接种安全性评价结果 单位：%

3.2 妊娠母羊免疫效果评价

为进行新生羔羊母源抗体获得水平的评价，本研究首先评价了怀孕母羊产前抗体水平。如图1 结果所示，在对M.ovi 及Pm 抗体水平评价中，免疫前2 组怀孕母羊相应抗体水平均较低，组间没有统计学差异；在免疫后14 d，免疫试验组母羊M.ovi 及Pm 抗体水平出现较大幅度上升，与PBS 对照组相比差异极显著；在免疫后28 d，免疫试验组母羊M.ovi 及Pm抗体水平依然维持在较高水平，与PBS 对照组相比依然存在极显著差异。

图1 怀孕母羊M.ovi 及Pm 抗体水平

3.3 新生羔羊母源抗体获得水平评价

为进行新生羔羊母源抗体获得水平的评价，本研究对妊娠120 d 母羊进行灭活疫苗免疫，并在羔羊出生第1、3、6、9、12 和15 天进行采血，以评价母源抗体获得水平。抗体检测结果如图2 所示，在对M.ovi 抗体水平评价中，羔羊出生第1 天抗体水平组间无统计学差异；在出生后3 d 时，免疫试验组母羊所产羔羊抗体水平达到最大值，与PBS 对照组所产羔羊抗体相比差异极显著，PBS 对照组所产羔羊抗体与第1 天相比出现下降；在出生后6、9、12 和15 d 时，免疫试验组母羊所产羔羊抗体水平与PBS 对照组所产羔羊抗体均出现下降，但组间差异比较显著。

图2 新生羔羊母源M.ovi 及Pm 抗体获得水平

在对Pm 抗体水平评价中，羔羊出生第1 天抗体水平组间无统计学差异； 在出生后3、6、9、12 和15 d时，PBS 对照组所产羔羊抗体水平与第1 天相比均出现不同程度的下降，但免疫试验组母羊所生羔羊抗体水平变化并不明显，因此两组间相比差异极显著。

3.4 新生羔羊母源抗体被动免疫效果评价

为确定获得母源抗体被动保护羔羊的保护效果，新生羔羊在出生60 d 后对其进行剖检，观察呼吸系统病变情况，并依据肺脏病变评分标准进行评测。结果如图3 所示，PBS 对照组所产羔羊肺脏右侧前叶及左右侧中叶出现肉样实变，病变现象明显。免疫试验组母羊所产羔羊肺脏粉红有弹性，未见明显病变。对2 组肺脏分别评分后，组间差异极显著，评分结果见图4。

图4 新生羔羊剖检肺脏病变评分结果

4 讨论

目前由于现有支原体双价灭活疫苗覆盖病原谱窄，预防效果并不理想。本研究通过对内蒙古地区各区域羊场优势流行菌株进行分离并筛选候苗株，尝试研制出针对绵羊烂肺病的M.ovi、Pm（A/D 型）联合灭活疫苗。为考查该疫苗对妊娠期母羊免疫接种的安全性，对孕后期母羊进行了连续免疫单一剂量免疫试验及单次超剂量免疫试验。试验结果发现，怀孕羊未出现早产、流产现象及征兆，所产羔羊未出现致畸现象，证明本疫苗对怀孕母羊安全可靠无副作用。同时为进一步确定新生羔羊通过初乳获得免疫母羊母源抗体的水平，以高繁湖羊怀孕母羊及其新生羔羊为研究对象，采用ELISA 检测对怀孕母羊及新生羔羊血清抗体水平进行评价。结果显示，怀孕母羊在接受1 次三联灭活疫苗免疫后即可产生抗M.ovi 及Pm 抗体，且与PBS 对照组相比差异极显著。

新生羔羊在接受免疫母羊充足初乳饲喂后，免疫试验组母羊所产羔羊可获得相应被动性保护抗体，且与PBS 对照组母羊所产羔羊相比差异极显著。这说明母源抗体可通过初乳有效传递给新生羔羊。同时为进一步印证试验效果，本团队在新生羔羊出生60 d 后进行迫杀剖检，剖检结果与ELISA 结果相符，接受母源抗体被动保护的羔羊得到有效保护。

5 结论

本团队新研制的绵羊肺炎支原体-多杀性巴氏杆菌A/D 型三联灭活疫苗应用于孕后期母羊时安全可靠，未出现流产、弱羔、早产2 周龄羔羊及致畸等情况。

本团队新研制的绵羊肺炎支原体-多杀性巴氏杆菌A/D 型三联灭活疫苗免疫孕畜后，初生羔羊可通过被动免疫，使相应抗体水平上升，获得可靠的免疫保护。