祛风宣肺方通过背根神经反射降低咳嗽敏感性的作用机制研究

李雅兰 马建岭 史利卿 王 颖 罗敬月 罗景舒 李扭扭

(1 北京中医药大学,北京,100029; 2 北京中医药大学东方医院呼吸热病科,北京,100078; 3 浙江省中医院呼吸科,杭州,310006; 4 首都医科大学附属北京胸科医院中医科,北京,101149)

咳嗽作为机体清除呼吸道有害刺激的一种防御机制,但若咳嗽过度,则会成为一种病理现象。依据咳嗽持续时间的不同,咳嗽可分为急性咳嗽(<3周)、亚急性咳嗽(3～8周)和慢性咳嗽(>8周)3类。其中咳嗽时间>8周,X线检查无明显异常的慢性咳嗽,由于咳嗽持续时间长,诊治困难,成为人们于呼吸科、耳鼻喉科就诊的主要原因之一[1]。现代研究认为瞬时受体电位香草酸亚型1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1)通道激活介导气道神经源性炎症,进而增加咳嗽反射的敏感性可能是其重要机制之一[2]。神经源性炎症因为有背根神经反射参与故更容易诱发炎症瀑布[3]。本团队在对慢性咳嗽病因病机认识的基础上,结合长期临床用药经验创立祛风宣肺方,用于治疗慢性咳嗽取得较好临床疗效。本研究通过探讨祛风宣肺方对咳嗽敏感性增高豚鼠背根神经节中TRPV1、P物质(Substance P,SP)、降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-related Peptide,CGRP)蛋白及基因的作用,进一步探讨祛风宣肺方的作用机制,为其临床应用提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取48只2周龄无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级雄性健康Hartley豚鼠,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物使用许可证号:SCXK(京)2016-0011,体质量200～250 g,饲养于北京中医药大学东方医院动物房。饲养条件:SPF级动物房,温度23 ℃,湿度60%。本研究通过北京中医药大学东方医院动物实验伦理委员会审查(伦理审批号:201907),研究内容和过程中涉及的实验动物,均符合国家对医学实验动物的有关要求。

1.1.2 药物 祛风宣肺方(由炙麻黄、炙百部、炙紫菀等组成,本院药剂室煎煮,浓缩,制备成含生药量为2 g/mL的膏剂);Capsazepine(MCE公司,美国,货号:HY-15640)。

1.1.3 试剂与仪器 卵蛋白(sigma,美国,货号:S30353);Anti-TRPV1(Abcam,英国,货号:ab6166);Anti-神经激肽1受体(Neurokinin 1 Receptor,NK-1R)(NOVUS,美国,货号:nb300-119);Anti-CGRP(LSBIO,货号:c12345)。高速低温离心机(Sigma,美国,型号:3-30K);电泳仪(Bio-Rad,美国,型号:EPS 300);0.22 μm聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜(Millipore,美国,型号:ISEQ00010);3MM滤纸(Whatman,英国,型号:3030861);电热恒温水浴槽(上海一恒,型号:HWS-24);凝胶成像系统(Bio-Rad,美国,型号:GelDoc-It310);ChemiDoc MP化学发光成像系统(Bio-Rad,美国,型号:170-8280)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 48只豚鼠适应性饲养3 d后,采用随机数字表法随机分为正常对照组、模型组、西药组、中药组4组,每组12只。除正常对照组外,其他组参照文献[4]采用卵蛋致敏的方法建立咳嗽敏感性增高豚鼠模型,具体方法如下:依据体质量每只豚鼠以30 mg/kg的剂量腹腔注射环磷酰胺溶液,2 d后每只豚鼠腹腔注射含有2 mg卵蛋白+100 mg氢氧化铝的混悬液1 mL,3周后腹腔内再加强注射1次含有0.01 mg卵蛋白+100 mg氢氧化铝的混悬液1 mL,以使豚鼠致敏。加强免疫后3周,将各组豚鼠置于雾化箱内,雾化吸入10 mg/mL的卵蛋白溶液90 s激发,以诱发咳嗽。

1.2.2 给药方法 造模成功后,正常对照组及模型组给予生理盐水灌胃,1次/d,共干预7 d;西药组给予Capsazepine(辣椒平,TRPV1通道阻滞剂)腹腔注射1 μmol/kg,1次/d,共干预7 d;中药组给予祛风宣肺膏方(炙麻黄、炙百部、炙紫菀等,本院药剂室煎煮,浓缩,制备成膏剂)灌胃,根据成人日用剂量,按照动物系数折算,给药量按生药量计算约5 g/kg(1倍人的等效剂量),1次/d,共干预7 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 辣椒素雾化法测定各组豚鼠的咳嗽次数 各组豚鼠给药干预结束后次日,将其置于自制雾化箱内,雾化吸入辣椒素溶液(浓度为50 μmo1/L)5 min。豚鼠出现明显的腹部收缩伴伸脚、伸颈、张口甚则伴有清脆咳嗽声等特征性表现时,则可记录咳嗽次数1次,记录人员在计数豚鼠咳嗽次数时,不知其具体分组情况,观测记录10 min(含雾化时间5 min)内咳嗽的总次数。

1.2.3.2 实时PCR法检测背根神经节中TRPV1、SP、CGRP mRNA水平 腹主动脉取血处死豚鼠后,将豚鼠俯卧置于冰面,剖开皮肤,钝性分离,暴露颈胸椎骨,以颈部最隆突(第二胸椎棘突)处定位C7～T5棘突,于正中处分离椎管,暴露脊髓。用显微外科镊将脊髓推向一侧,暴露并挑起脊神经,在椎间孔处可见背根神经节。用显微外科剪分离相应神经节,锡纸包裹,快速放入冷冻管,液氮速冻,保存于-80 ℃冰箱。每组随机选取8只豚鼠,取背根节组织加入液氮研磨粉碎后加入1 mL Trizol,将其吸取到1.5 mL EP管中,加入500 μL酚氯仿,振荡混匀,静止5 min,4 ℃ 12 000 r/min,离心半径13.5 cm,离心10 min,小心吸取上清液于一新的离心管中,加入700 μL异丙醇,混匀,于4 ℃ 12 000 r/min,离心半径13.5 cm,离心10 min,小心去上清液,75%乙醇洗涤1次,晾干,溶于50 μL焦碳酸二乙酯水溶解DNA沉淀,电泳检测提取总RNA。使用核酸浓度测定仪测定RNA浓度和纯度。使用逆转录试剂盒Superscript Ⅲ将RNA逆转录成cDNA。实时PCR体系建立后,将其混匀,瞬离,置于荧光定量PCR仪上,按照以下条件反应:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,共40次循环扩增。扩增反应结束后按95 ℃ 15 s,60 ℃60 s,95 ℃ 15 s建立PCR产物的溶解曲线,每个样品重复3次。见表1。

表1 TRPV1、SP、CGRP、PCR引物序

1.2.3.3 蛋白印迹法检测背根节中TRPV1、NK1-R、CGRP蛋白表达 每组随机选取4只豚鼠,取一定大小的背根节组织,加入蛋白提取液进行蛋白提取,二喹啉甲酸蛋白定量法测定蛋白浓度后,行十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白分离,进而将蛋白转移到PVDF膜上,将转移膜置于封闭液中,室温摇床慢摇1 h后分别加入一抗4 ℃冰箱过夜,加入二抗室温摇床慢摇1 h,后用TBST洗膜。采用ECL试剂盒让其显影,后将其放入化学发光成像系统成像并拍照,最后对目标条带的灰度值进行分析。

2 结果

2.1 一般情况 模型组饲养过程中死亡1只、卵蛋白雾化激发时死亡1只,共死亡2只;西药组饲养过程中死亡1只、卵蛋白雾化激发时死亡2只,共死亡3只;中药组卵蛋白雾化激发时死亡1只。剩余豚鼠,正常对照组豚鼠毛发光泽,轻度掉毛,体质量、呼吸、进食水量、活动等一般状态良好,经过造模的各组豚鼠掉毛较正常对照组多,体质量、呼吸、进食水量等与正常对照组无差异。

2.2 咳嗽次数 与正常对照组比较,模型组咳嗽次数增加(P=0.003<0.01);与模型组比较,中药组、西药组咳嗽次数降低(P=0.000<0.01,P=0.002<0.01);中药组与西药组比较,二者咳嗽次数差异无统计学意义(P=0.801>0.05)。见表2。

表2 各组豚鼠的咳嗽次数[次,M(P25,P75)]

2.3 各组豚鼠背根节组织中TRPV1、SP、CGRP mRNA表达 与正常对照组比较,模型组背根节中TRPV1、SP、CGRP mRNA表达升高(P<0.01);与模型组比较,西药组、中药组背根节中TRPV1、SP、CGRP mRNA表达下降(P<0.01);与西药组比较,中药组背根节中TRPV1、SP、CGRP mRNA表达升高(P<0.01)。见表3。

表3 各组豚鼠背根节组织TRPV1、SP、CGRP mRNA表达

2.4 各组豚鼠背根节组织中TRPV1、NK-1R、CGRP蛋白表达 与正常对照组比较,模型组背根节中TRPV1、NK-1R、CGRP蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,西药组背根节中TRPV1、NK-1R、CGRP蛋白表达下降(P<0.05);与模型组比较,中药组背根节中NK-1R、CGRP表达下降(P<0.05);与模型组比较,中药组背根节中TRPV1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与西药组比较,中药组背根节中CGRP表达升高(P<0.05),中药组与西药组背根节中TRPV1、NK-1R蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图1,表4。

图1 各组豚鼠背根节组织中TRPV1、NK-1R、CGRP蛋白质印迹

表4 各组豚鼠背根节中TRPV1、NK-1R、CGRP蛋白表达

3 讨论

慢性咳嗽属中医“久咳”“内伤咳嗽”的范畴,中医对其认识历史悠久,研究发现风邪为慢性咳嗽的重要病因。风为百病之长,易兼夹它邪侵袭机体,造成正气亏虚,祛邪不尽,风邪留伏于肺,出现呼吸道敏感性增高的表现,如冷空气、油烟、异味等外邪即可诱发或加重咳嗽,另外,慢性咳嗽患者咽痒、咳嗽突发突止的主要临床表现与“无风不作痒”“风性善行而数变”的风邪致病特点不谋而合[5]。本团队提出风邪伏肺是慢性咳嗽的核心病机并创祛风宣肺方,方中炙麻黄辛温发散、重在宣肺;青风藤可治诸风,与炙麻黄合用起到祛风宣肺的效果;前胡性微寒、为清热下气化痰的要药,如《本草纲目》云:“前胡,乃手足太阴、阳明之药……其功长于下气,故能治痰热喘嗽……”厚朴性温、具有行气燥湿化痰的作用;炙百部、炙紫苑共奏润肺行气、止咳化痰之功,全方寒温并用、升降相因,在降低咳嗽敏感性方面临床疗效显著。

慢性咳嗽发病机制复杂,目前普遍认为气道神经源性炎症是引起咳嗽敏感性增高的重要机制,其持续存在是导致慢性咳嗽迁延反复的十分重要的一个原因。关于气道神经源性炎症,以往研究更多地关注迷走神经的参与,但是迷走神经并不是介导气道炎症的唯一传入纤维,背根节传入神经也支配肺和气道[6-7]。刘春丽等[8]在一项关于胃食管反流性咳嗽的豚鼠活体实验中提出背根反射可能也是参与气道神经源性炎症的重要神经通路。感觉神经末梢受到刺激后,释放的神经肽或神经递质介导的炎症反应称为神经源性炎症,神经源性炎症反应与背根反射密切相关[9-10]。

背根反射的基础是初级传入神经末梢去极化(Primary Afferent Depolarization,PAD),当初级传入神经元将兴奋传入中枢时,除了直接将信息向高级中枢传递,还可经过“特殊”的中间神经元与原传入神经元或其他初级传入神经元以“轴-轴”突触形式形成环路,这一特殊的中间神经元将兴奋传至末梢时,释放特殊递质,从而出现PAD,PAD过度则可产生冲动,经背根逆向传出,形成背根神经反射[11-12]。有关豚鼠气道交感神经反射调节的研究提示:背根节神经元支配呼吸道和肺部,气道感觉神经纤维受到刺激后,神经冲动一方面可直接传递至神经中枢,产生咳嗽,另一方通过背根神经反射将神经冲动逆传至周围神经元,使神经纤维末梢释放大量神经肽物质诱发神经源性炎症,刺激咳嗽感受器导致异常咳嗽的发生[13]。因此,神经源性炎症因为有背根神经反射的参与,较传统炎症更容易诱发炎症瀑布。

瞬时受体电位香草酸亚型1TRPV1作为首个被克隆的瞬时受体电位通道,在无髓鞘的C纤维和有髓鞘的Aδ纤维上均有分布,在背根神经节、三叉神经节、颈神经节的神经元上高表达[14-16]。SP和CGRP主要在背根神经节中合成、释放到外周,介导神经源性炎症,并且CGRP能够抑制SP酶的降解从而加强SP相关效应[17-18]。TRPV1通道受到外源或内源物质刺激时,会促使SP、CGRP、神经激肽A(Neurokinin A,NKA)等神经肽递质的释放,继而出现局部组织血管扩张和通透性增加、炎症细胞渗出、黏膜充血水肿、支气管收缩等炎症现象[19-20],因此不断刺激咳嗽感受器,诱发咳嗽产生。吕俊等[21]通过烟熏结合内毒素滴鼻及辣椒素刺激复制感染后咳嗽模型,检测各组老鼠背根节中TRPV1的表达,结果显示与正常对照组比较,模型组背根节中TRPV1的蛋白及基因表达增加,提示TRPV1可通过背根反射诱发气道神经源炎症增加咳嗽的敏感性,引起咳嗽。

本研究结果提示与正常对照组比较,模型组豚鼠背根节中TRPV1、SP、CGRP的蛋白及基因表达升高,可见采用卵蛋白致敏的方法建立慢性咳嗽模型可以通过兴奋背根节中TRPV1通道,释放SP、CGRP等神经肽物质,进而诱发气道神经源性炎症,导致咳嗽的产生。治疗后,祛风宣肺方中药组及Capsazepine抑制剂组背根节中TRPV1、SP、CGRP基因表达及NK-1R、CGRP蛋白表达较模型组下降,提示祛风宣肺方可通过抑制背根反射,抑制TRPV1通道,减少SP、CGRP的释放,进而减轻气道神经源性炎症而产生治疗作用。

虽然祛风宣肺方在降低背根节组织中TRPV1、SP、CGRP蛋白及基因表达方面效果不及西药TRPV1抑制剂,但其在降低模型豚鼠咳嗽次数中作用不劣于西药阻滞剂,体现了祛风宣肺方多途径、多靶点的作用特点,祛风宣肺方可能通过抑制TRPV1通道进而减轻气道神经源性炎症而发挥治疗作用,同时其可能亦可通过其他途径发挥治疗作用,未来亦需要更多研究进一步探讨其作用机制。

利益冲突声明:无。