雄性激素诱导的长链非编码RNA LINC01126促进前列腺癌细胞增殖、凋亡及Warburg效应

纪金宏 马晓倩 刘新雅 何昆仑

(衡水市人民医院,河北 衡水 053000)

前列腺癌(PCa)具有地域性和种族性。在西方国家,尤其是欧美等发达国家中的男性最为常见的,同时也是较为严重的一种疾病,其死亡率在所有癌症中位居前1/3〔1〕;PCa在亚洲的发病概率较西方国家发病概率小,但是近年来PCa的病例也在逐年增加〔2〕。在我国PCa多为晚期,已发生转移。常见给予抗雄激素治疗,具有一定的治疗效果,但在治疗1年后几乎全部患者均会转变为去势抵抗性PCa,至今尚无较好的解决方案。PCa早期无特异性特征,导致大部分患者一经发现已为晚期,因此早期诊断对于治疗至关重要〔3,4〕。长链非编码 RNA存在于细胞核与细胞质中,LINC01126是其成员之一,研究发现〔5〕,在人体基因组中有近6万个lncRNA基因的表达。已有研究证实〔6〕,lncRNA在基因转录调节等过程中具有重要作用,还可通过顺式/反式调控其他基因水平。除此之外〔7〕,lncRNA在多种肿瘤中均存在异常表达,可通过调控细胞的增殖、转移等过程参与肿瘤的产生及发展。导致肿瘤转移产生的主要原因是促进及抑制癌细胞转移的因素水平失衡,癌细胞能量代谢模式(Warburg效应解)的开启带来的相关效应(癌细胞转移促进基因的激活)在打破这种失衡中发挥了重要作用,但具体机制目前尚未完全了解。本研究雄性激素诱导的长链非编码RNA LINC01126促进PCa细胞增殖、凋亡及Warburg效应。

1 材料和方法

1.1实验试剂 LINC01126、雄激素受体(AR)引物序列(上海晶能生物公司);聚合酶链反应(PCR)仪(南京康维达生物公司,型号:QuantStudio 3);噻唑蓝(MTT)溶液(武汉普诺赛生命科技公司);结晶紫溶液(上海尚宝生物公司);流式细胞仪(北京焕彩元合科技公司,型号:BD FACSCanto Ⅱ);酶标仪(济南霍尔德电子科技公司,型号:HED-SY96S)。

1.2细胞来源及培养 人PCa细胞DU145、PC3、LNCaP、IA8及正常前列腺细胞RWPE-1均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。DU145、PC3、LNCaP、IA8用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养,所有细胞均在37 ℃、5%CO2条件下培养。待细胞生长至80%时胰酶消化、离心、重悬、传代,取第3代进行实验。

1.3组织标本来源 PCa组织、癌旁组织、肝癌组织、乳腺癌组织、胃癌组织、膀胱癌组织、食管癌组织、肾癌组织标本来源于衡水市人民医院2019年5月至2020年4月收治的上述疾病患者(已经过病理确认),每个疾病取5个肿瘤组织标本,且已经过患者及家属同意,本研究经过医院伦理委员会审核批准(批准文号:Y2019-010-18)。

1.4AR载体构建及转染 AR载体的构建及转染根据文献〔8〕进行:载体用T4 DNA Ligase酶连接AR基因与pCDNA3.1+载体进行构建,提取质粒。前1 d将细胞接种至培养基中(无抗生素),融合至80%后,分为空白组、对照组(转染空载体)及转染组。将质粒加入24孔板中,稀释至100 μl为Z液。取1 μl Lipofectamine2000溶解于培养基为L液,Z、L液混合后加到培养板中。4 h后更换培养基,48 h后收样。

1.5检测指标

1.5.1实时荧光定量(qRT)-PCR检测LINC01126、AR水平 取各细胞及剪碎的PCa组织与癌旁组织,加入0.125%胰蛋白酶裂解后,将细胞悬液放于试管中。利用Trizol法检测提取总RNA,按照Micro RNA反转录试剂盒说明书对总RNA进行反转录。LINC01126上游引物:5′-AGCGTAAGGGTGGAGAAAGC-3′,下游:5′-CTGAGGTCACCTG CTCTTGG-3′;AR上游引物:5′-ATGGAAGTGCAGTTAGGGCTGG-3′,下游:5′-TCACTGGGTGTGGA AATAGATGGG-3′;内参GAPDH上游引物:5′-TTGATCTTCATGAGCTAGGAGCGAAGGGGA-3′,下游:5′-TGACGGTCAGGTCATGACTATCGGCAATGA-3′。PCR条件:95 ℃ 5 min、95 ℃ 5 s、59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s以上40个循环,72 ℃延伸10 min。以2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.5.2MTT测细胞增殖 将LNCaP(4×103)接种至96孔板,上述方法将细胞分为空白组、对照组与转染组,并给予相应的转染。待细胞密度至60%时,换液,分别孵育12、24、48 h 后,加入MTT溶液孵育4 h,运用酶标仪检测光密度(OD)值,并判断细胞增殖能力。

1.5.3Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 迁移:将LNCaP细胞消化制成悬液,上室加入200 μl细胞(1×105)悬液,将750 μl含10%胎牛血清(FBS)的培养基加入下室,常规培养48 h,取出小室后弃上清,多聚甲醛固定,结晶紫染色,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后于显微镜下观察。侵袭:预先用无血清培养基将Matrigel (50 mg/L)稀释(1∶4),包被Transwell小室底部膜,4 ℃风干,水化基底膜。其余步骤同迁移实验。

1.5.4流式细胞仪测凋亡 将LNCaP(1×105/ml)接种至6孔板,培养24 h,胰酶消化后PBS清洗,离心后弃上清。混入500 μl结合缓冲液 重悬。加入 5 μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素酶(Annexin Ⅴ-FITC)混匀、 10 μl碘化丙啶(PI)混匀,室温避光孵育5～15 min,随即进行流式细胞仪检测。

1.5.5Warburg效应检测 葡萄糖摄取:将LNCaP(1×105个/孔)接种于6孔板中,加20 μg/ml PSL,24 h后将培养基补至2 ml,常规培养48 h后收集培养液。以初始细胞葡萄糖量作为空白,制备反应液,混匀后进行水浴反应,酶标仪测吸光度。乳酸生成:空白均以初始细胞为准,配制反应液(样本、酶工作液、显色液;0.02 ml∶1 μl∶0.2 ml),混匀后水浴中进行反应,酶标仪测吸光度。

1.6统计学分析 采用SPSS23.0软件进行方差分析,两组间对比采用t检验。

2 结 果

2.1LINC01126在不同组织中的表达 与肝癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、肾癌等组织(0.85±0.06、0.82±0.07、0.84±0.06、0.86±0.05、0.83±0.03、0.81±0.08)相比,PCa组织中LINC01126表达明显较高(1.02±0.03;P<0.001),表明LINC01126在PCa组织中呈现高表达。此后,用PCa组织与癌旁正常组织做了进一步检查,发现PCa组织中的LINC01126表达水平(1.97±0.14)显著高于癌旁正常组织(1.00±0.01,P<0.05)。

2.2LINC01126在各细胞中的表达 RWPE-1中LINC01126表达(1.00±0.04)明显低于在DU145、PC3、LNCaP、IA8中的表达(2.81±0.15、2.79±0.17、3.14±0.16、2.77±0.20;F=250.500,P<0.001)。LNCaP中LINC01126表达显著高于在PC3、DU145、IA8中的表达(P<0.05)。因此,本文选用LNCaP细胞进行后续实验。

2.3各组LNCaP细胞LINC01126及AR mRNA比较 空白组与对照组LNCaP细胞中LINC01126、AR表达水平对比无明显差异(P>0.05)。转染AR后转染组LNCaP细胞中AR mRNA水平显著高于对照组(P<0.05),提示AR转染成功。同时,LNCaP细胞中LINC01126水平也随之增加,与对照组相比差异显著(P<0.05),提示雄激素增加可诱导LINC01126水平升高,见表1。

2.4各组LNCaP细胞增殖比较 空白组与对照组不同时间点LNCaP细胞的OD值相比均无显著差异(P>0.05)。转染组不同时间点LNCaP细胞OD值均显著高于空白组、对照组(P<0.05),见表1。

2.5各组LNCaP细胞迁移及侵袭比较 空白组与对照组LNCaP细胞迁移及侵袭数量无差异(P>0.05)。转染组LNCaP细胞迁移及侵袭数量显著高于空白组、对照组(P<0.05),见表1、图1。

2.6各组LNCaP细胞凋亡率比较 空白组LNCaP细胞凋亡率〔(6.54±0.58)%〕与对照组〔(6.12±0.64)%〕相比无显著差异(t=1.191,P=0.261)。转染组LNCaP细胞凋亡率〔(0.15±0.03)%〕显著低于对照组(t=22.820,P<0.001),见图2。

表1 各组LINC01126、AR mRNA水平、OD值、迁移及侵袭数量比较

图1 各组LNCaP细胞侵袭及迁移(结晶紫染色,×200)

图2 各组LNCaP细胞凋亡率

2.7各组LNCaP细胞Warburg效应比较 空白组〔(3.26±0.21)、(4.84±0.31)mmol/L〕与对照组LNCaP细胞葡萄糖摄取量及乳酸生成量〔(3.01±0.32)、(4.62±0.43)mmol/L〕比较无统计学差异(P>0.05)。转染组LNCaP细胞葡萄糖摄取量及乳酸生成量〔(6.42±0.67)、(9.36±0.72)mmol/L〕显著高于空白组、对照组(t=11.020、14.120,P<0.05)。

3 讨 论

研究表明〔9〕,雄性激素是诱导的PCa患者死亡的主要原因。雄激素诱导PCa的主要机制可能是〔10〕:AR基因增加,促进了肿瘤雄性激素增加,从而增加对抗雄激素药物产生应答;通过改变AR相关作用,使得突变的AR被激活,通过改变相关因子的表达与功能,从而使AR异常活化,促进肿瘤的发展。本研究提示,尽管LINC01126在PCa中特异性表达的机制尚不明确,但LINC01126与PCa病情发展联系密切。将其转染至列腺癌细胞中发现,在雄激素受体AR水平升高的同时,LINC01126表达增加,这提示,LINC01126与AR可能存在一定的调控关系,本文进一步研究提示,AR水平的增加通过影响LINC01126表达促进PCa的发展。在浦洪雷等〔11〕的实验中提出,高表达的LINC01126促进前列腺癌的发展,减少癌细胞凋亡。曾颖科等〔12〕研究中提出,AR受体水平增加会使雄性激素水平增加,AR的表达与PCa细胞的恶性程度呈正相关。胡晶晶等〔13〕研究中提出,雄激素受体AR与长链非编码RNA PCRL存在一定的调控关系,AR通过提高PCRL水平可促进PCa的发展,减少癌细胞凋亡。本研究与上述研究结果相似,因此本文推测,雄性激素可能通过诱导LINC01126水平增加,促进PCa细胞的增殖、侵袭、迁移并抑制凋亡。

Warburg效应是肿瘤代谢异常的表现,促进肿瘤细胞的增殖及转移〔14,15〕。这种能量代谢方式的转变受许多复杂因素的调控,主要表现为增强糖酵解作用,抑制线粒体的氧化磷酸化。其中,葡萄糖的极大吸收和乳酸生成是肿瘤Warburg效应的重要特征〔16〕。研究显示〔17〕,肿瘤将大量乳酸释放到细胞外时,由于细胞内的乳酸浓度比率发生变化,使得免疫细胞不能释放自身乳酸,从而使自身乳酸窒息而亡,导致免疫逃逸,从而促进肿瘤转移。本实验中给予AR转染后,LINC01126水平增加同时癌细胞代谢的乳酸生成量及葡萄糖摄取量明显增加。吴守振等〔18〕研究提出,在PCa中葡萄糖摄取量及乳酸生成量会增加,通过抑制Warburg效应,可抑制癌细胞的活性。张勇等〔19〕在实验中提出,长链非编码 lncRNA-p21通过增强PCa Warburg效应,促进癌细胞的增殖及迁移能力。本研究与上述研究结果类似,因此本文推测,雄性激素可能是通过诱导LINC01126水平增加后,增强了Warburg效应,从而促进了PCa细胞的增殖、侵袭、迁移能力并减少细胞凋亡。