Mfn2通过Ras-Raf-ERK1/2信号通路抑制ARDS肺纤维化及其机制

安宁 许涛 张晓霞 杨涛 许美霞

(华中科技大学同济医学院 1附属协和医院麻醉与危重病研究所,湖北 武汉 430022;2武汉市第四医院重症医学科)

在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)早期即出现肺纤维化,但其具体的机制尚不清楚。研究发现,ARDS肺纤维化的发生与肺泡上皮细胞再生障碍、纤维蛋白代谢异常、血管生成反应增强等有关外,肺成纤维细胞增殖是肺纤维化的关键因素〔1～5〕。线粒体融合蛋白(Mfn)2是近年新发现的一种增殖抑制基因,其凭借结构和功能上的特征,参与调控多种细胞的增殖、凋亡等生物学过程。本研究通过转染携带不同Mfn2基因片段腺病毒,探讨Mfn2基因影响肺成纤维细胞增殖抑制ARDS肺纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1试剂与材料 人胚肺成纤维细胞(HELF)购于中国科学院细胞资源库。脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司,考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所,Sircol胶原测定试剂盒购于英国Biocolor公司,rMfn2多克隆抗体及二抗购于GenWay Biotech Inc公司,Ras、Raf-1多克隆抗体、细胞外调节蛋白激酶(ERK)单克隆抗体(来源于兔)购自Abcam公司,抗兔二抗购自武汉博士德生物有限公司,引物由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司合成。

1.2HELF的培养 取HELF细胞株,用含体积分数10%胎牛血清及双抗的DMEM培养基,在37 ℃、5%CO2培养箱中培养细胞,每12 h更换新的培养基,每5～6 d传代1次,取对数生长期细胞备用。

1.3腺病毒重组体构建及感染 Mfn2基因开放读码框编码含有757个氨基酸残基的蛋白质,包括N端三磷酸鸟苷(GTP)酶结构域(aa1-264)、C端跨膜区(aa265-757)。通过构建腺病毒重组体Adv-Mfn21-264-绿色荧光蛋白(GFP)、Adv-Mfn2265-757-GFP、Adv-Mfn21-757-GFP分别转染肺成纤维细胞,使其分别过表达Mfn2的N端GTP酶结构域(aa1-264)、C端跨膜区(aa265-757)及Mfn2的全长氨基酸(aa1-757)。腺病毒重组体Adv-Mfn21-264-GFP、Adv-Mfn2265-757-GFP、Adv-Mfn21-757-GFP及腺病毒空载体Adv-vector由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司构建并测序鉴定。

1.4实验分组 将HELF分为:Control组、Adv-vector组、LPS组、Adv-Mfn21-264-GFP组、Adv-Mfn2265-757-GFP组、Adv-Mfn21-757-GFP组。Control组:予以完全培养基培养24 h;Adv-vector组:用含100 MOI腺病毒载体Adv-vector培养48 h后,DMEM培养基继续培养24 h;LPS组:模型组给予5 μg/ml LPS+培养液培养24 h;Adv-Mfn21-264-GFP组:含100 MOI腺病毒载体Adv-Mfn21-264培养48 h后,经验证过表达Mfn2的N端GTP酶结构域(aa1-264),继续LPS(浓度5 μg/ml)、DMEM培养基培养24 h;Adv-Mfn2265-757-GFP组:含100 MOI腺病毒载体Adv-Mfn2265-757培养48 h,经验证过表达Mfn2的C端跨膜区(aa265-757),继续LPS(浓度5 μg/ml)、DMEM培养基培养24 h;Adv-Mfn21-757-GFP组:含100 MOI腺病毒载体Adv-Mfn21-757培养48 h,经验证过表达Mfn2的全长氨基酸(aa1-757),继续LPS(浓度5 μg/ml)、DMEM培养基培养24 h。

1.5噻唑蓝(MTT)法检测HELF增殖情况 取对数生长期HELF以5×104接种于96孔培养板内,按分组分别诱导处理之后,每组样本设4个复孔,置入培养箱中贴壁培养24 h。吸弃旧的培养液,每孔分别加20 μl 的MTT,孵育4 h后,吸出上清液,加入100 μl的二甲基亚砜(DMSO),震荡20 min,在570 nm的波长下,用多功能酶标仪测量光密度(OD)值。

1.6HELF细胞内胶原蛋白含量的测定 各组细胞体外培养约24 h后,提取细胞内总蛋白,考马斯亮蓝法检测细胞内总蛋白水平,使用Sircol胶原试剂盒检测细胞内胶原蛋白水平,根据公式〔细胞内胶原蛋白含量(μg/mg Prot)=待测样本的细胞胶原含量(μg/ml)/待测样本的细胞总蛋白含量(mg/ml)〕计算出细胞内胶原蛋白水平在细胞内总蛋白水平中变化比例。

1.7Western印迹检测Raf-1、ERK1/2蛋白表达水平 收集各组待测细胞,裂解液提取总蛋白后,用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度。12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜(PVDF)上,封闭液室温封闭1 h,用5%脱脂奶粉溶液按 1∶1 000 稀释兔抗Ras抗体,1∶700稀释兔抗Raf抗体,1∶400稀释兔抗ERK1/2抗体,室温下孵育120～150 min,磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜后,加入1∶2 000稀释的二抗,孵育2 h,经PBS再次洗膜后,用电化学发光(ECL)显影。

1.8实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Ras、Raf-1、Erk1/2基因的表达水平 收集各组细胞,使用Trizol试剂提取总RNA,按照反转录试剂盒说明书进行cDNA反转,逆转录得到的cDNA作模板,GAPDH为内参。逆转录cDNA的反应条件:25 ℃ 5 min,50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min,4 ℃ 10 min;RT-qPCR条件:第一循环50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,共40个循环。绘制溶解曲线,最终数据以2-ΔΔCt进行分析。引物序列:GAPDH正义链5′-CCCATCTAT GAGGGTTACGC-3′、反义链5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′;Ras正义链5′-ATTTGCCATCAACAACACCA-3′、反义链5′-GAGCAGCCAGGTCACACTT-3′;Raf-1正义链5′-CATCAACAACCGAGACCAGA-3′、反义链5′-CAGTCAGCCACCAACCTCTT-3′;Erk1/2正义链5′-CTTCCAACCTCCTGCTGAAC-3′、反义链5′-TCTGTCAAG AACCCTGTGTGA-3′。

1.9统计学处理 采用SPSS26.0软件进行方差分析,两组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1MTT法观察肺成纤维细胞增殖情况 Control组与Adv-vector组细胞增殖水平无明显差异(P>0.05);与Control组比较,LPS组第2、3、4、5、6天细胞增殖水平均明显增加(P<0.01);转染不同Mfn2基因片段后,与LPS组比较,Adv-Mfn21-264-GFP组、Adv-Mfn2265-757-GFP组、Adv-Mfn21-757-GFP组肺成纤维细胞增生受到抑制,细胞增殖水平明显下降(P<0.01)。见表1。

表1 各组HELF细胞增殖情况值,n=3)

2.2HELF细胞内胶原蛋白的含量变化 与Control组比较,LPS组胶原蛋白含量明显增加(P<0.01);与LPS组比较,Adv-Mfn21-264-GFP组、Adv-Mfn2265-757-GFP组、Adv-Mfn21-757-GFP组细胞内胶原蛋白含量明显下降(P<0.01)。见表2。

2.3肺成纤维细胞Ras、Raf-1、ERK1/2蛋白及mRNA表达情况 与Conttrol组相比较,LPS组Ras、Raf-1、ERK1/2蛋白及mRNA表达明显增加(P<0.01),转染不同Mfn2基因片段后,与LPS组比较,Adv-Mfn21-264-GFP组、Adv-Mfn2265-757-GFP组、Adv-Mfn21-757-GFP组Ras、Raf-1、ERK1/2蛋白及mRNA表达明显减少(均P<0.01)。见表2、图1。

表2 各组细胞内胶原蛋白含量、Ras、Raf-1及ERK1/2蛋白及mRNA表达水平

1～6:Control组、Adv-vector组、LPS组、Adv-Mfn21-264-GFP组、Adv-Mfn2265-757-GFP组、Adv-Mfn21-757-GFP组图1 各组细胞Ras、Raf-1及Erk1/2蛋白的表达水平

3 讨 论

Mfn2分布广泛,其功能除介导线粒体融合外,还参与细胞信号转导、细胞增殖及凋亡等生物学过程〔6,7〕。研究发现,在血管平滑肌细胞(VSMC)异常增殖性疾病如高血压,平滑肌细胞中的Mfn2表达显著降低,而上调Mfn2表达可抑制VSMC的增殖〔8〕。在心肌纤维化疾病中,Mfn2可抑制气道成纤维细胞增殖并诱导其凋亡〔9〕。同时研究发现,Mfn2低表达与膀胱癌等肿瘤性疾病密切相关〔10〕。这些研究结果表明,Mfn2可以抑制多种细胞的增殖。前期研究〔11〕亦发现,过表达Mfn2可抑制成纤维细胞的增殖,但其具体的效应结构尚不清楚。而本研究结果提示,Mfn2的N端GTP酶结构域、C端跨膜区可能均参与成纤维细胞增殖的调控。

Ras基因编码4种高度保守的Ras蛋白,其活性通过与GTP或二磷酸鸟苷(GDP)结合进行调节。Ras是调节细胞生长及增殖的重要蛋白,其下游主要信号通路包括Ras-Raf-ERK1/2、Ras-磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)及RalGEF,其中Ras-Raf-ERK1/2与细胞增殖功能密切相关。当Ras突变或被上游信号激活处于持续活化状态时,它可激活下游效应蛋白,引起细胞异常增殖,甚至导致肿瘤发生〔6〕。Mfn2的N端GTP酶结构域与Ras有相似的分子结构,而Mfn2的C端的跨膜区与Ras效应蛋白NORE1A有57%同源性,这些特殊结构为Mfn2与Ras信号通路相互作用提供了结构基础。研究发现,Mfn2的N端p21ras共有模体与Ras结合,通过Ras-Raf-ERK1/2细胞信号通路抑制B细胞淋巴瘤细胞的增殖〔12〕。在小鼠胚胎成纤维细胞中,Mfn2与Ras结合后抑制Ras蛋白活化,使下游Raf及ERK1/2失活,而剔除p21ras结构后,Mfn2丧失了上述效应〔12,13〕。在VSMC和神经胶质细胞中过表达Mfn2,Raf及ERK1/2水平下降〔14,15〕。这些研究提示,Mfn2可通过Ras-Raf-ERK1/2影响细胞增殖。我们前期通过Co-IP蛋白免疫共沉淀法检测发现Mfn2可能通过与Ras结合抑制肺成纤维细胞增殖〔16〕。本研究结果提示,Mfn2的N端GTP酶结构域、C端跨膜区均可通过调控Ras-Raf-ERK1/2信号通路影响成纤维细胞异常增殖,但具体的氨基酸相互作用关键位点后期仍需进一步研究。