祛风清热凉血方介导CTGF、TGFβ1参与银屑病的治疗

马晓惠 王增强 程晓蕾 毛婷婷 陈宏

(天津市人民医院皮肤科,天津 300121)

银屑病是由免疫介导的严重影响患者的身心健康和生活质量的慢性、炎症性、复发性、系统性疾病〔1〕。其发病机制尚未明确,遗传、免疫、环境、精神等因素均可能是其发病因素。近年来研究发现其发病可能与角质形成细胞的过度增殖、炎症细胞的浸润和新生血管的形成有关〔2〕。银屑病皮损处存在血管异常和微循环障碍,而银屑病的病理过程最早发生于真皮血管的异常增生〔3〕,所以对银屑病机制的研究越来越多的集中在血管新生对银屑病的影响。转化生长因子(TGF)β1具有免疫抑制作用,是角质形成细胞(KC)的负调控因子,通过 TGFβ1/活化素受体样激酶(ALK)1/Smad同源物1/5重组蛋白(Smad1/5)途径参与新生血管形成〔4〕。银屑病、伤口愈合障碍、瘢痕形成及皮肤肿瘤等多种皮肤病的发病机制均与TGFβ1表达异常有关〔5〕。结缔组织生长因子(CTGF)一方面可通过改变细胞外基质(ECM)的结构或稳定性,促进血管的新生。另一方面,CTGF也可以促进胶原蛋白合成,进而合成ECM,支持新形成的血管床结构〔6〕。CTGF是TGFβ1的下游介质,CTGF与TGFβ1具有较为相似的生物学特征并相互作用〔7〕。

有研究报道,祛风清热凉血方对寻常型银屑病血热毒热证患者疗效确切,但其作用机制尚不清楚〔8〕。本研究通过分析银屑病面积严重程度指数(PASI)评分及外周血中CTGF、TGFβ1水平以探讨祛风清热凉血方治疗银屑病的潜在机制。

1 材料与方法

1.1病例诊断及入选标准 选取2018年1月至2019年7月天津市人民医院皮肤性病科就诊患者40例(治疗组),依据中国银屑病诊疗指南(2018完整版)〔9〕制定的寻常型银屑病诊断标准,治疗前1个月未服用或外用其他治疗银屑病药物者。男25例,女15例,年龄23～78岁,平均(45.50±17.26)岁。8 w后随访治疗组20例,失访率约为50%,失访原因涉及皮损消退及病情好转自动停用中药、旅居外地、更改其他治疗方案等。健康对照组20 例,均来自同期在天津市人民医院体检的正常健康人,其中男11例,女9例,年龄24～59岁,平均年龄(33.90±8.78)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。入组对象均签署知情同意书,且本研究经过医院医学伦理委员会审查通过。

1.2排除标准 严重的心肺功能不全、严重的心律失常者;合并严重感染、恶性肿瘤、自身免疫病、肝、肾、神经、造血系统等严重原发性疾病者;妊娠、哺乳期妇女;严重内脏功能不全、传染性疾病;对本课题中药制剂过敏者;中重度抑郁或精神病患者等不能配合治疗方案者。退出实验:不按规定按时服药者;自行合并使用对研究治疗有影响药物的受试者;因严重不良事件必须停止治疗者;无不良反应但因其他原因而中断治疗者。

1.3标本免疫组织化学染色 采用免疫组织化学染色方法检测CTGF、TGFβ1在两组中的表达。染色步骤按照链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)试剂盒方法,磷酸盐缓冲液(PBS)液代替一抗作阴性对照。 一抗为兔抗人CTGF多克隆抗体(工作浓度为1∶300)及兔抗人TGFβ1多克隆抗体(工作浓度为1∶200)。 石蜡切片常规脱蜡至水,抗原修复10 min (98 ℃),5 ml/L过氧化氢封闭30 min(37 ℃),山羊血清封闭30 min (37 ℃),一抗过夜(4 ℃),二抗30 min(37 ℃),三抗30 min(37 ℃),二氨基联苯胺(DAB)显色3 min,苏木素染色4 min,盐酸酒精分化5 s,自来水冲洗40 min,脱水、透明、封片。以健康对照组皮肤组织为阴性对照。用显微镜(OLYMPUS BX51)采集图片,用图像分析软件(Image-Pro Plus6.0)测定阳性细胞光密度值及染色面积。每张切片随机选取3个视野(400倍)分别测定记录阳性细胞的累积光密度值(IOD)和面积(area)值,计算出平均光密度(IOD/area)值,平均光密度值越大代表两因子相对表达量越高。

1.4治疗方法 治疗组给予中药汤剂祛风清热凉血方,方药组成:赤芍10 g,金银花15 g,黄柏10 g,白茅根20 g,炒牛蒡子10 g,生地20 g,连翘15 g,知母10 g,黄芩10 g,白鲜皮10 g,玄参10 g,苦参10 g,荆芥15 g,升麻2.5 g,甘草5 g,防风10 g。每日1剂,水煎分早晚2次温服。连续治疗8 w。同时配合卤米松,卡泊三醇外用。治疗前,治疗4、8 w后各抽血样离心的血清,另收集健康对照组外周血清保存于-80 ℃冰箱。

1.5疗效评判 皮损情况根据PASI评分法评分,治疗前及治疗4、8 w后分别进行1次PASI评分。分值0～72分〔10〕。

1.6实时荧光定量PCR(qPCR) 参照Trizol试剂(美国Invitrogen公司)说明书进行总RNA的提取。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒(美国Thermo公司)将总RNA逆转录为cDNA,再进行qPCR检测。实时荧光定量PCR特异性引物序列:GAPDH正义:5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′,反义:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′,CTGF正义:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′,反义:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′,TGFβ1正义:5′-ACACCAACTATTGCTTCAG-3′,反义:5′-ACAC CAACTATTGCTTCAG-3′。采用荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行相对定量分析。GAPDH作为内参,采用2-ΔΔCt公式对CTGF、TGFβ1基因表达进行相关计算。每组试验重复3次。

1.7CTGF、TGFβ1水平检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA),操作步骤按试剂盒说明书。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、秩和检验、χ2检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1两组CTGF、TGFβ1表达 健康对照组CTGF和TGFβ1在表皮全层及真皮中通常无表达或较低表达;治疗组皮损组织中CTGF和TGFβ1呈显著高表达(P<0.001),可见表皮角化不全,棘细胞层明显增厚,真皮毛细血管增生。见图1、表1。

图1 两组皮肤组织GTFG、TGFβ1表达(免疫组化染色)

表1 两组皮肤组织CTGF及TGFβ1表达比较

2.2祛风清热凉血方可降低寻常型银屑病患者PASI评分 治疗组经祛风清热凉血方治疗4、8 w后PASI评分较首诊显著下降(t=9.162、12.556,均P<0.05)。见表2。

2.3祛风清热凉血方可降低寻常型银屑病患者外周血CTGF、TGFβ1表达 治疗组首诊和治疗4 w血清中CTGF、TGFβ1表达量明显高于健康对照组(P<0.05),首诊、治疗4、8 w CTGF、TGFβ1表达量呈逐渐下降趋势,治疗4 w与首诊,治疗8 w与首诊相比,差异均存在统计学意义(P<0.05)。ELISA结果显示,首诊、治疗4、8 w治疗组CTGF、TGFβ1 mRNA明显高于健康对照组(P<0.05),且治疗4、8 w显著低于首诊(P<0.05)。见表2。

表2 治疗组首诊、治疗4、8 w PASI评分及两组CTGF、TGFβ1表达比较

2.4CTGF、TGFβ1表达水平与寻常型银屑病患者PASI评分相关性 寻常型银屑病患者CTGF与TGFβ1呈显著正相关(r=0.802),外周血CTGF表达水平(r=0.903)、TGFβ1表达水平与PASI评分均呈显著正相关(r=0.545,均P<0.001)。

3 讨 论

银屑病是以局限或全身分布的鳞屑性红斑或斑块为典型临床表现,银屑病皮损的组织病理表现为表皮角化过度、角化不全、棘层肥厚,真皮乳头血管扩张和淋巴细胞为主的炎细胞浸润〔11〕。故多数研究认为其发病与角质形成细胞的过度增殖、炎症细胞的浸润和新生血管的形成有关,且最先发生病变的为微血管的形成,而随着疾病的缓解这种血管新生的病理改变也会随之消退〔12〕。

CTGF是血管重构的必要因子,本研究结果显示,寻常型银屑病患者血清中CTGF呈高表达,且随着病情的好转,CTGF的表达亦逐渐下降。考虑其机制可能由于CTGF的高表达,从而促进了血管新生,导致并加重了银屑病的皮损〔13〕。TGFβ1可以通过刺激成纤维细胞的增殖,诱导血管新生及舒张,从而参与银屑病的发生〔14〕。报道显示TGFβ1能够通过对Smads通路的激活而提升CTGF的表达量,CTGF表达上调则会进一步激活TGFβ1和增强其的生物学效应〔7〕。

银屑病属中医学“白疕”范畴,本方由祛风清热解毒药和凉血活血药组成,现代药理研究表明,祛风清热解毒类中药具有抗菌消炎,调节免疫和抑制表皮细胞过度增殖作用〔15〕。凉血活血类中药具有促进组织的修复与再生,调节机体细胞因子的水平和抗血管新生的作用〔16〕。之前的研究发现祛风清热凉血方治疗能够明显改善银屑病患者的PASI评分,中药辨证治疗银屑病疗效肯定〔9〕,但是由于缺乏足够的现代分子生物学证据得不到广泛推广和运用。 本研究显示随着中药祛风清热凉血方对患者症状和证候的改善,外周血CTGF、TGFβ1表达水平下调,这意味着祛风清热凉血方可能通过介导银屑病患者CTGF、TGFβ1的表达下调发挥治疗作用,推测中药可能通过抑制血管新生相关因子,从而纠正银屑病患者天然免疫功能紊乱,抑制变态免疫反应,进而抑制银屑病患者角质形成细胞的增殖,达到治疗作用。但这些推测有待进一步的细胞生物学相关实验研究探索相关因子作用通路,以确定血管新生在银屑病中的确切机制及中药的具体作用靶点。