扶金化积丸对环磷酰胺治疗Lewis肺癌荷瘤小鼠的化疗增敏作用及机制

夏小军 雷旭东 段赟 陈浩方 郭炳涛 马骏 赵文秀 李文基

(1甘肃省肿瘤医院中西医结合肿瘤防治中心,甘肃 兰州 730050;2甘肃中医药大学药理教研室)

肺癌是最常见的致人死亡的疾病之一,其发病率逐年上升〔1〕。据报道,2018年全球新增肺癌病例209万例,位于所有癌症之首〔2〕。肺癌通常分为两大类,约15%的病例为小细胞肺癌,而85%为非小细胞肺癌。由于肺癌早期无明显的临床症状及缺少精准有效的诊断方法,大多数肺癌病人确诊时已处于中晚期并伴随转移,从而错过最佳治疗机会〔3〕。目前化疗结合靶向治疗可作为肺癌的一线治疗方法。然而,肺癌患者5年生存率仍低于20%〔4〕。环磷酰胺(CTX)是一种广泛应用于肿瘤治疗的化疗药物〔5〕,其抗肿瘤机制是通过抑制DNA合成杀死肿瘤细胞,但同时可引起一些副作用,如白细胞减少、骨髓抑制、免疫抑制等〔6〕。中医药治疗肺癌具有来源广、成本低、不良反应少、靶点多等诸多优势。中药复方对肺癌疗效显著,可有效缓解化疗引起的免疫抑制〔7〕。目前,中药复方开发与应用已成为肿瘤研究的热点。本研究探讨中药复方扶金化积丸对环磷酰胺治疗Lewis肺癌荷瘤小鼠的化疗增敏作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1仪器 全自动血液分析仪(上海涵飞医疗器械有限公司);包埋机(浙江省金华市科迪仪器);显微镜(宁波舜宇仪器有限公司);电子天平(慈溪市天东衡器厂)。

1.2药品与试剂 扶金化积丸(甘肃省肿瘤医院甘肃省医学科学研究院提供,批号20190325)。RPMI1640培养基(美国Hyclone公司,批号:AE24464298);0.25%胰蛋白酶(上海翊圣生物科技有限公司,批号:T3926890);胎牛血清(美国Life Technologies Corporation公司,批号:42G327016);小鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司,批号:1906M);小鼠干扰素(IFN)-γ试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司,批号:1906M);小鼠白细胞介素(IL)-2试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司,批号:1906M);中性树胶(北京索莱宝科技有限公司,批号:G8590);苏木素(北京索莱宝科技有限公司,批号:G1080);基质金属蛋白酶(MMP)-9抗体(美国Proteintech公司,批号:0066523);核因子(NF)-κB抗体(美国Gene Tex公司,批号:41556)。

1.3细胞株 Lewis细胞株购自和元生物技术(上海)股份有限公司。

1.4动物 C57BL/6小鼠,40只,雄性,体质量(20±2)g,由中国农业科学院兰州兽医研究所提供,动物生产许可证号:SCXK(甘)2015-0001;合格证号:0000952。

1.5药液配制 扶金化积丸:用生理盐水配制成浓度为0.087 5 g/ml的药液,备用。注射用CTX:用生理盐水配制成浓度为1 mg/ml的药液,备用。

1.6荷瘤小鼠模型的建立、分组及给药 将Lewis细胞株于RPMI1640培养基(含10%胎牛血清、1% 双抗)中培养,0.25%胰酶(含乙二胺四乙酸、酚红)消化,调整细胞浓度约为2×106/ml。以C57BL/6小鼠为研究对象,右腋皮下接种细胞悬液0.2 ml/只,共40只,制成Lewis荷瘤小鼠模型。接种约1 w后,待肿瘤长至粒径0.5 cm时,将其随机分成荷瘤对照组、扶金化积丸组、CTX组、扶金化积丸+CTX(联合)组,8只/组,另取8只小鼠作空白对照。分组后除正常组和荷瘤对照组灌胃等体积生理盐水外,扶金化积丸组灌胃1.749 g/kg(相当于临床人用量30倍)扶金化积丸药液,CTX组腹腔注射20 mg/kg(相当于临床人用量的3.3倍)CTX药液,联合组同时灌胃扶金化积丸药液和CTX药液。每天一次,共计14 d。停药1 h后,称定小鼠体质量,眼球采血。采血后小鼠脱颈椎处死,取瘤体、胸腺及脾脏待测。

1.7瘤重、瘤体积及抑瘤率 用游标卡尺测量瘤体长、短径,称重并记录。参照下列公式计算瘤体体积及抑瘤率:瘤体体积=长径×短径2。抑瘤率(%)=(荷瘤对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/荷瘤对照组平均瘤质量)×100%。

1.8脏器指数 称量胸腺及脾脏重量,并按如下公式计算器官指数:器官指数(mg/g)=〔器官湿重(mg)/体质量(g)〕×100%。

1.9血常规 采用全自动血液分析仪进行血细胞计数及血红蛋白(HGB)浓度检测。

1.10血清细胞因子TNF-α、IL-2、IFN-γ含量的检测 按照试剂盒说明书,用酶联免疫吸附试剂盒检测荷瘤小鼠血清细胞因子TNF-α、IL-2、IFN-γ含量。

1.11瘤组织病理学检测 瘤组织在10%甲醛溶液中固定24 h,于包埋盒中用流水清洗30 min,不同浓度酒精(由低到高)脱水,二甲苯透明瘤组织,将已透明瘤组织于溶蜡箱浸蜡包埋成块,切成薄片,脱蜡水化,苏木素-伊红染色,中性树胶封片后于显微镜下观察。

1.12免疫组化检测瘤组织中NF-κB和MMP-9的表达 取瘤组织,10%甲醛固定,石蜡包埋,制作瘤块切片,随后经脱蜡、水化,自来水冲洗,柠檬酸钠加热修复抗原,3%过氧化氢孵育封闭内源性过氧化物酶,磷酸盐缓冲液漂洗,依次给予一抗(1∶200)、二抗稀释液分别进行孵育,孵育结束并用磷酸盐缓冲液漂洗后再进行二氨基联苯胺(1∶20)显色,观察可见棕黄色时终止显色反应,再用苏木素进行复染约1 min,不同浓度酒精(由低到高)脱水,中性树胶封片,光学显微镜拍照,运用图像分析软件对瘤体中NF-κB、MMP-9表达进行分析。

1.13统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1对荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响 与荷瘤对照组比较,扶金化积丸组、CTX组及联合组荷瘤小鼠瘤重及瘤体体积均显著减小(P<0.01,P<0.001),抑瘤率分别达19.26%、22.32%、30.19%;与CTX组比较,联合组瘤重、瘤体体积均显著降低(P<0.05)。提示联合用药的抑瘤效果优于单独使用CTX。见表1。

2.2对荷瘤小鼠血常规的影响 与荷瘤对照组相比,扶金化积丸组红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血小板(PLT)数目及HGB浓度显著升高(P<0.001),联合组WBC数目显著上升(P<0.001);与CTX组比较,扶金化积丸组及联合组RBC、WBC、PLT数目及HGB浓度显著升高(P<0.01,P<0.001)。见表1。

表1 扶金化积丸联合CTX对荷瘤小鼠瘤重及瘤体积及血常规的影响

2.3对荷瘤小鼠脏器指数的影响 与正常组比较,荷瘤对照组胸腺指数显著下降(P<0.001),而脾脏指数显著上升(P<0.001)。与CTX组比较,扶金化积丸组及联合组胸腺、脾脏指数均显著增大(P<0.001),提示CTX抗肿瘤时可抑制荷瘤小鼠免疫,而扶金化积丸可缓解其对免疫器官的抑制作用。见表2。

2.4对荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2、IFN-γ含量的影响 与荷瘤对照组比较,扶金化积丸组、联合组血清中TNF-α、IL-2、IFN-γ含量显著升高(P<0.05,P<0.01),CTX组TNF-α含量显著升高(P<0.05);与CTX组比较,扶金化积丸组IL-2含量显著升高(P<0.001),联合组TNF-α、IL-2含量显著升高(P<0.05,P<0.001)。见表2。

2.5对荷瘤小鼠瘤组织形态的影响 荷瘤对照组肿瘤细胞形态结构稳定,核固缩较少,偶见坏死,瘤组织内血供充盈;扶金化积丸组有明显坏死,坏死区域较大,并伴出血情况,出现细胞凋亡;CTX组有散在出血,肿瘤细胞大小不均,胞质被成片染成红色且颜色较深;联合组肿瘤细胞排列不紧密,坏死及凋亡现象增强。见图1。

2.6对瘤组织中NF-κB、MMP-9表达的影响 与荷瘤对照组比较,扶金化积丸组、CTX组及联合组荷瘤小鼠瘤体中NF-κB、MMP-9表达均显著降低(P<0.01,P<0.001);与CTX组比较,联合组与扶金化积丸组NF-κB、MMP-9表达略有回升,但无统计学意义(P>0.05)。见图2、见表3。

表2 扶金化积丸联合CTX对荷瘤小鼠脏器指数及血清中TNF-α、IL-2、IFN-γ含量影响

图1 扶金化积丸联合CTX对荷瘤小鼠肿瘤细胞形态的影响(免疫组化染色,×200)

图2 扶金化积丸联合CTX对瘤体中NF-κB、MMP-9表达的影响(免疫组化染色,×200)

表3 扶金化积丸联合CTX对瘤组织中NF-κB、 MMP-9表达的影响

3 讨 论

CTX被广泛应用于各种肿瘤的治疗。但由于毒性和免疫系统损害,其临床应用受到了极大的限制。因此,很有必要研发一种辅助治疗方法来减少CTX的不良副作用并增强其疗效。中药复方由于其独特的优势,如提高生存率、抑制肿瘤生长、缓解术后症状和并发症等,长期以来被用于非小细胞肺癌的治疗〔8〕。研究显示,中药复方联合化疗比单纯化疗更能有效抑制Lewis肺癌的生长和转移〔9〕。本研究结果显示,扶金化积丸可有效增强CTX对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用并缓解CTX引起的免疫抑制。扶金化积丸是根据祖国中医中药辨证施治的理论研制出的纯中药制剂,系研制者经数十年的临床实践而拟定的验方,用于肺癌的临床治疗。处方组成:西洋参20 g,黄芪30 g,岷当归15 g,麦门冬10 g,五味子10 g,女贞子10 g,旱莲草10 g,山萸肉15 g,鸡血藤10 g,百合15 g,龙葵10 g,川芎10 g,莪术10 g,玄参10 g,浙贝母10 g,生牡蛎10 g,薏苡仁15 g,山楂10 g。方中主药西洋参补气养阴、清热生津;辅药黄芪补气固表;岷当归补血止血;鸡血藤行血补血;生脉散(《内外伤辨惑论》西洋参、麦门冬、五味子)、百合养阴润肺、生津止咳;二至丸(《医便》女贞子、旱莲草)、山萸肉补益肝肾、滋阴止血;佐药消瘰丸(《中医方剂临床手册》玄参、浙贝母、生牡蛎)清热化痰、软坚散结;龙葵散瘀消肿、清热解毒;莪术、川芎活血行气止痛;使药薏苡仁渗湿健脾;山楂散瘀化积、助运脾胃。诸药合用,对因痰、瘀、毒而致气阴两虚的肺积,可奏益气养阴、扶正祛邪之功效。胸腺和脾脏分别是重要的初级和次级淋巴器官。脾脏主要产生成熟的淋巴细胞,包括Th型和Tc型淋巴细胞。早先的研究显示,CTX可引起胸腺和脾脏指数下降〔9〕。本研究结果显示,扶金化积丸处理后可有效提高小鼠胸腺和脾脏指数。RBC、WBC、PLT及HGB起源于骨髓并分布于血液中。化疗后外周血中RBC、WBC、PLT数目及HGB浓度的下降反映了肿瘤患者的骨髓抑制。与之前报道相一致的〔10〕,本研究发现,CTX可导致小鼠外周血中RBC、WBC、PLT数目及HGB浓度的下降,而给予扶金化积丸可有效减轻CTX引起的上述改变。

血清细胞因子在免疫系统调节宿主防御中起着重要作用。IL-2对应答性T细胞增殖起促进作用,IFN-γ可抑制肿瘤细胞生长并诱导凋亡〔11,12〕。研究表明,人参浆果多糖可通过上调TNF-α和IFN-γ诱导有效的宿主保护性免疫反应〔13〕。本研究结果提示,扶金化积丸可增强小鼠的免疫防御功能。

NF-κB作为一个重要的转录因子,广泛参与到细胞凋亡、炎症反应、病毒复制和各种自身免疫性疾病过程中〔14〕。在非小细胞肺癌中,MMP-9的活性与远处转移呈正相关。此外,研究显示MMP-9高表达可作为肿瘤分期及不良预后的一个危险因素〔15〕。本研究结果表明,扶金化积丸、CTX单独或二者联合应用均可有效抑制瘤组织中NF-κB和MMP-9的表达水平,从而发挥抗肿瘤作用;但是联合应用并没有呈现出更佳的效果。

综上所述,扶金化积丸可增强CTX对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用,其作用机制与减轻CTX引起的机体免疫抑制有关。