TGFA通过PI3K/AKT信号通路对骨关节炎小鼠软骨细胞增殖和凋亡的影响

崔国峰 刘丹 武军龙 魏戎 刘瑞宇 王坤正

(1西安交通大学附属第二医院骨与关节外科,陕西 西安 710004;2郑州大学附属洛阳中心医院骨科;3西安医学院第一附属医院风湿免疫科)

骨关节炎(OA)是一种慢性关节退行性疾病,以膝OA(KOA)最为常见,主要发生在中老年人群体,以关节软骨退变为主要病理特征〔1～3〕。关节软骨退变过程涉及软骨细胞的性状改变、数量减少及骨基质退行性病变〔4〕。研究表明,正常的软骨细胞是确保细胞外基质状态稳定的必要条件,而软骨细胞增殖、凋亡行为的失衡是软骨退行性病变引起OA发生的关键〔5〕。目前尚无能有效治愈OA的方法,OA的临床治疗主要在于延缓病情进展〔6,7〕。从软骨细胞增殖、凋亡方面着手或可为寻找新的OA治疗药物指明方向。转化生长因子α(TGFA)是表皮生长因子(EGF)家族成员,可结合EGF受体引发各种信号转导级联反应,在细胞行为调控方面发挥重要作用〔8〕。既往研究显示,TGFA能增强上皮细胞增殖和运动〔9〕。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)是机体中的基础信号通路之一,参与绝大多数生命活动,如其激活后可促进癌细胞增殖、侵袭〔10〕。有研究发现,PI3K/AKT通路与OA发病关系密切,其激活后可抑制软骨细胞凋亡〔11,12〕。本研究将探讨TGFA通过PI3K/AKT信号通路对OA小鼠软骨细胞增殖和凋亡的影响,以期为延缓OA病情提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠,体质量20～30 g,8周龄,购自杭州科玲生物科技有限公司,许可证号:SCXK(浙)2020-0007。小鼠购进后适应性喂养1 w,12 h/12 h明暗光照,温度19～23 ℃,相对湿度40%～60%,自由摄食饮水。

1.2主要试剂与仪器 小鼠Ki67、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3免疫组化试剂盒(IHC0117710、IHC0118094)及噻唑蓝(MTT)溶液(YS290LG)、膜联蛋白(Annexin)Ⅴ-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒(G003)购自雅吉生物;DMEM培养基(iCell0001)购自上海iCell;白细胞介素(IL)-1β(GFM68-2)、TGFA(GFH209-10)购自英国CellGS;LY294002(HY-10108)购自美国MedChemExpress;兔抗p-PI3K(KF275)、兔抗PI3K(KF650)、兔抗p-AKT(KF044)、兔抗AKT(KF359)、兔抗GAPDH抗体(KF703)、羊抗兔IgG(KS002)购自南京建成生物工程研究所;兔抗Ki67(db901)、兔抗Caspase-3(db9853)购自戴格生物;BX53显微镜购自日本OLYMPUS;51119000全自动酶标仪购自美国赛默飞;AMG0002051流式细胞购自美国BD;ChemiDocTMXRS+凝胶成像仪购自美国Bio-Rad。

1.3OA小鼠模型制备及实验分组 OA小鼠模型复制〔13〕:小鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,固定,双侧后肢消毒、备皮,在膝关节处切开皮肤(3 mm),钝性分离肌肉,暴露关节腔和内侧半月板胫骨韧带,将内侧半月板韧带划断,止血,生理盐水冲洗伤口,缝合关节腔软组织及皮肤,给予青霉素肌注3 d防感染。取8只OA小鼠为模型组,另取同期未划断内侧半月板韧带的8只小鼠为假手术组,正常饮水进食,自行活动4 w。

1.4免疫组化法检测软骨组织细胞增殖、凋亡情况 将小鼠断头处死,分离左后肢膝关节软骨组织用于Western印迹检测,分离右后肢膝关节软骨组织用4%多聚甲醛固定,放乙二胺四乙酸(EDTA)中脱钙,经脱水、包埋后切片(5 μm)。将切片脱蜡、水化、漂洗,加柠檬酸钠缓冲液用微波炉加热修复抗原10 min,冷却后用3%H2O2浸泡10 min,冲洗,分别滴加兔抗Ki67、兔抗Caspase-3,4 ℃孵育8 h,冲洗,滴加羊抗兔IgG二抗,孵育15 min,冲洗,用二氨基联苯胺(DAB)显色液显色、苏木素复染、盐酸乙醇分化、梯度乙醇复水、二甲苯透明后中性树胶封固,显微镜下观察染色结果,阳性细胞的胞质表现为棕黄色颗粒,计算阳性细胞率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5OA小鼠软骨细胞的分离、培养 取1只OA小鼠,断头处死,分离双后肢膝关节软骨组织,冲洗后切成1 mm3小块,胰酶消化30 min,Ⅱ型胶原蛋白酶消化3 h,过滤除去未消化组织,滤液经1 000 r/min离心5 min,弃上清获得OA小鼠软骨细胞,用含0.1 mg/ml青-链霉素及10%胎牛血清的DMEM培养基培养,2～3 d换液1次。

1.6OA小鼠软骨细胞分组及给药 将OA小鼠软骨细胞分为对照组、TGFA低浓度组、TGFA高浓度组及通路抑制组,均加10 ng/ml IL-1β模拟OA环境,TGFA低、高浓度组另分别加5、10 ng/ml TGFA〔14〕,通路抑制组加10 ng/ml TGFA及10 μmol/L LY294002〔14〕。

1.7MTT法检测细胞增殖 各组OA小鼠软骨细胞以5×104个/ml、100 μl/孔接种96孔板,培养24 h,加入50 μl/孔MTT溶液,继续培养4 h,加入200 μl/孔DMSO,酶标仪(490 nm)测定每孔光密度(OD)值,以OD值表示细胞增殖能力。

1.8流式细胞仪检测细胞凋亡 各组OA小鼠软骨细胞以5×104个/ml、100 μl/孔接种96孔板,培养24 h离心收集细胞,用结合缓冲液重悬为5×105个/ml,取500 μl细胞重悬液,依次加入10 μl Annexin Ⅴ-FITC、5 μl PI轻轻混匀,避光放置10 min,流式细胞仪进行检测,分析细胞凋亡率。

1.9Western印迹检测软骨组织、软骨细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白表达 小鼠左后肢膝关节软骨组织及以5×104个/ml、1 ml/孔接种6孔板并培养24 h的各组OA小鼠软骨细胞均用RIPA裂解液提取蛋白质,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白质含量,取蛋白样品以50 μg/孔点样、电泳、转膜、封闭,滴加p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、Ki67、Caspase-3、GAPDH抗体(1∶800),4 ℃孵育10 h,滴加羊抗兔IgG二抗(1∶1 200)孵育2 h,电化学发光(ECL)液染色,凝胶成像仪曝光、拍照,分析条带灰度,以与GAPDH灰度值的比值为目的蛋白表达水平。

1.10统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1假手术组及模型组软骨组织细胞增殖、凋亡情况 与假手术组相比,模型组软骨组织Ki67阳性细胞率显著降低,Caspase-3阳性细胞率显著升高(P<0.05),见表1、图1。

2.2假手术组及模型组软骨组织中PI3K/AKT通路及增殖、凋亡相关蛋白表达情况 与假手术组相比,模型组软骨组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05),见表1、图2。

2.3各组软骨细胞增殖情况 与对照组相比,TGFA低、高浓度组软骨细胞OD值显著升高(P<0.05);与TGFA低浓度组相比,TGFA高浓度组软骨细胞OD值显著升高(P<0.05);与TGFA高浓度组相比,通路抑制组软骨细胞OD值显著降低(P<0.05),见表2。

表1 两组软骨组织Ki67、Caspase-3阳性细胞率、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67、Caspase-3蛋白表达比较

图1 两组软骨组织Ki67、Caspase-3 阳性细胞表达(免疫组化染色,×200)

2.4各组软骨细胞中PI3K/AKT通路及增殖、凋亡相关蛋白表达情况 与对照组相比,TGFA低、高浓度组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67蛋白表达水平显著升高,Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与TGFA低浓度组相比,TGFA高浓度组软骨细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67蛋白表达水平显著升高,Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与TGFA高浓度组相比,通路抑制组软骨细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67蛋白表达水平显著降低,Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05),见图2、表2。

2.5各组软骨细胞凋亡情况 与对照组相比,TGFA低、高浓度组软骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与TGFA低浓度组相比,TGFA高浓度组软骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与TGFA高浓度组相比,通路抑制组软骨细胞凋亡率显著升高(P<0.05),见表2、图3。

1～6:假手术组、模型组、对照组、TGFA低浓度组、TGFA高浓度组、通路抑制组图2 各组p-PI3K、PI3K、p-AKT、 AKT、Ki67、Caspase-3蛋白表达

表2 各组软骨细胞OD值、凋亡率及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Ki67、Caspase-3蛋白表达比较

图3 各组软骨细胞凋亡情况

3 讨 论

软骨细胞是软骨组织唯一的细胞类型,也是软骨进行代谢活动的主要成分,参与合成软骨基质,其异常增殖及凋亡与OA的发生发展密切相关〔15〕。本研究采用划断后肢关节内侧半月板韧带的方式复制OA小鼠模型,验证了OA发病中软骨组织细胞增殖会异常降低,细胞凋亡异常升高。

TGF包括TGFA、TGF-β两种多肽类生长因子,其中TGF-β是一种多功能蛋白质,参与关节炎发病的炎症反应调节过程,而TGFA能诱导上皮进展,与EGF受体结合调控信号反应发挥作用〔16,17〕。研究发现,低氧诱导大鼠脂肪干细胞旁分泌因子〔包含TGFA、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)〕可以减轻子痫前期大鼠心肌组织细胞异常程度〔18〕。本研究结果表明,TGFA可减轻OA小鼠软骨细胞损伤,抑制细胞凋亡并促进细胞增殖,但其机制还需进一步研究。AKT信号通路是调控细胞增殖、凋亡、蛋白质合成、糖代谢等各种生命活动的重要通路,可通过膜蛋白PI3K从EGF受体、酪氨酸激酶受体等多种受体处接收信号后磷酸化激活,目前已被认为是软骨细胞凋亡的重要调控途径〔19,20〕。田胜兰等〔11〕研究发现,YKL-40可通过活化PI3K/AKT通路,抑制KOA兔软骨细胞凋亡,修复软骨损伤,延缓软骨退行性改变。李坤等〔19〕研究表明,上调miR-543可拮抗IL-1β诱导的软骨细胞损伤,促进软骨细胞增殖,可能与上调AKT1等表达有关。吕欣荣等〔20〕研究亦发现,独活寄生汤可治疗IL-1β诱导的软骨细胞损伤,其作用机制可能与上调PI3K、AKT表达有关。本研究结果表明,OA发生过程中PI3K/AKT通路受到抑制;TGFA可激活OA小鼠软骨细胞中PI3K/AKT通路。Hou等〔14〕和Tao等〔21〕研究亦表明,TGFA可与EGF受体相互作用活化PI3K和AKT,参与癌细胞的增殖、迁移。本研究进一步发现,TGFA可能通过激活PI3K/AKT通路,促进OA小鼠软骨细胞增殖并抑制细胞凋亡。

综上所述,TGFA可促进OA小鼠软骨细胞增殖并抑制细胞凋亡,其作用机制可能与激活PI3K/AKT通路有关。