白花丹素介导sirt1-FOXO1通路对糖尿病肾病大鼠氧化应激损伤的影响

高晓卫 刘迎迎 于潇 丁怡

(山东中医药大学附属医院 1急诊科,山东 济南 250014;2肾病科;3妇科)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病进展引起的肾脏形状与功能病变,临床可见大量蛋白尿、水肿,肾小球滤过率(GFR)降低,会导致肾衰竭等严重后果〔1,2〕。DN重点在于预防,需改善生活方式,严格控糖,对DN的发病机制探讨也是重中之重。研究表明,高糖引起氧化应激损伤参与DN进展〔3〕。高糖环境下,活性氧簇(ROS)刺激脂质过氧化,丙二醛(MDA)大量生成,抗氧化物质难以清除脂质过氧化物质,诱导肾脏细胞损伤与不可逆转的凋亡,促进肾纤维化〔4〕。白花丹素是提取自白花丹根部的物质,具有广泛的抗肿瘤〔5〕、抗炎〔6〕、缓解动脉粥样硬化〔7〕活性。研究〔8〕显示,白花丹提取物可缓解由高糖诱导的肾小球系膜细胞纤维化,对肾组织具有保护作用,但目前尚无文献支撑白花丹素是通过抗氧化应激发挥对肾脏的保护作用。沉默信息调节因子2相关酶(sirt)1-叉头框蛋白(FOX)O1是具有调控细胞增殖与氧化应激作用的通路。朱舜等〔9〕研究显示,丙泊酚可通过sirt1-FOXO1通路减轻大鼠心肌细胞氧化应激损伤,抑制其细胞凋亡。基于氧化应激在DN进程中的作用及sirt1-FOXO1通路在氧化应激中的作用,本研究探讨白花丹素通过介导sirt1-FOXO1通路对PN大鼠氧化应激损伤的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂 120只SD大鼠〔许可证号:SCXK(粤)2020-0051〕,购自珠海百试通生物科技有限公司。大鼠血肌酐(Scr)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(ZC-53922)购自上海茁彩生物科技有限公司;大鼠β2微球蛋白(β2-MG)ELISA试剂盒(ml003391)、大鼠白细胞介素(IL)-1β ELISA试剂盒(ml037361)、大鼠超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(ml077379)、大鼠MDA ELISA试剂盒(ml077384)、大鼠IL-6 ELISA试剂盒(ml102828)购自上海酶联生物科技有限公司;尿蛋白定量测试盒(SNM297)购自北京百奥莱博;过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(S0051)、TUNEL凋亡检测试剂盒(C1089)购自上海碧云天;Anti-sirt1(GTX01139)、Anti-FOXO1(GTX135251)、Anti-GAPDH(GTX100118)均购自GeneTex;Goat Anti-Rabbit IgG H&L(ab6721)二抗购自美国Abcam公司。

1.2造模及分组 对照组给予普通饲料、自由饮水,其余组大鼠给予高脂高糖饲料、自由饮水。实验前禁食不进禁水12 h,戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉,备皮,逐层分离皮肤,暴露肾周脂肪,止血钳提起肾周组织暴露右肾,剥离周围脂肪,切除右肾,逐层缝合皮肤。待大鼠苏醒后,禁食不禁水12 h后,大鼠腹腔注射链脲佐菌素〔10〕(40 mg/kg,10 mg/ml)。72 h后,测血糖,以2次结果均高于16.7 mmol/L为造模成功。造模成功随机分为DN组、白花丹素低、高剂量组〔11〕、EX-527组〔12〕、白花丹素高剂量+EX-527组。进行药物处理,白花丹素低、高剂量组分别灌胃10、50 mg/kg白花丹素,1次/d,EX-527组尾静脉注射5 mg/kg sirt1抑制剂,注射1次/w。对照组和DN组注射等量生理盐水,1次/d,持续8 w。

1.3血清血糖指标、肾脏指标检测 末次给药后,收集受试大鼠24 h尿液,试剂盒法检测大鼠24 h尿蛋白;血糖仪检测大鼠空腹血糖(FBG)水平;腹主动脉取血,分离血清,试剂盒法检测Scr、血β2-MG水平。

1.4左肾指数 各组随机选取10只大鼠,剥离大鼠左侧肾脏,称重,左肾指数=左肾质量/大鼠体质量。

1.5大鼠肾脏组织氧化应激、炎症指标测定 取1.4中左肾组织,平均分为两份(冰上进行),一部分按照一定比例(1∶9)加入预冷生理盐水研磨,离心,取上清,试剂盒法检测肾组织匀浆中SOD、MDA、CAT、IL-1β、IL-6含量;另一部分-80 ℃保存待测。

1.6过碘酸雪夫(PAS)染色 各组随机选取10只大鼠,戊巴比妥钠麻醉处死取左肾,取部分左肾组织甲醛固定,乙醇脱水,石蜡包埋,脱水,过碘酸氧化(1%),冲洗,擦干后在希夫(Schiff)液中浸染(10 min),流水冲洗,苏木素染核,脱水(梯度乙醇)、透明(二甲苯)、封片,光镜下观察肾脏病理。

1.7TUNEL检测肾组织细胞凋亡 取1.6中部分石蜡切片,脱蜡(二甲苯),脱水(梯度酒精法),磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,固定(4%多聚甲醛),蛋白酶K处理,按TUNEL试剂盒说明书染色,光镜下观察染色结果,棕黄色即为阳性凋亡细胞,随机选取5个视野,以阳性细胞所占百分比表示凋亡率。

1.8Western印迹法检测sirt1-FOXO1通路相关蛋白表达 取1.5下冻存肾脏组织,液氮条件下研磨,裂解(蛋白裂解液),提取组织总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)试剂盒定量。上十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜;5%脱脂奶粉封闭1 h;加入一抗sirt1(1∶3 000)、FOXO1(1∶2 000)、GAPDH(1∶5 000),4 ℃孵育过夜;加入二抗(1∶5 000),室温孵育1 h。经增强型化学发光法进行检测。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组24 h尿蛋白、FBG、Scr、β2-MG水平比较 与对照组相比,DN组24 h尿蛋白、FBG、Scr、β2-MG水平均显著升高(P<0.05);与DN组相比,白花丹素低、高剂量组24 h尿蛋白、FBG、Scr、β2-MG水平均显著降低(P<0.05),EX-527组24 h尿蛋白、FBG、Scr、β2-MG水平均显著升高(P<0.05);与白花丹素高剂量组相比,白花丹素高剂量+EX-527组24 h尿蛋白、FBG、Scr、β2-MG水平显著升高(P<0.05)。见表1。

2.2各组左肾指数比较 与对照组相比,DN组左肾指数显著升高(P<0.05);与DN组相比,白花丹素低、高剂量组左肾指数显著降低(P<0.05),EX-527组左肾指数显著升高(P<0.05);与白花丹素高剂量组相比,白花丹素高剂量组+EX-527组左肾指数显著升高(P<0.05)。见表1。

2.3各组SOD、MDA、CAT、IL-1β、IL-6水平比较 与对照组相比,DN组肾组织匀浆中SOD、CAT水平均显著降低,MDA、IL-1β、IL-6水平均显著升高(P<0.05);与DN组相比,白花丹素低、高剂量组肾组织匀浆中SOD、CAT水平均显著升高,MDA、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05),EX-527组肾组织匀浆中SOD、CAT水平均显著降低,MDA、IL-1β、IL-6水平均显著升高(P<0.05);与白花丹素高剂量组相比,白花丹素高剂量+EX-527组肾组织匀浆中SOD、CAT水平均显著降低,MDA、IL-1β、IL-6水平均显著升高(P<0.05)。见表2。

2.4各组sirt1-FOXO1通路相关蛋白表达比较 与对照组相比,DN组肾组织sirt1、FOXO1蛋白表达均显著降低(P<0.05);与DN组相比,白花丹素低、高剂量组肾组织sirt1、FOXO1蛋白表达均显著升高(P<0.05),EX-527组肾组织sirt1、FOXO1蛋白表达均显著降低(P<0.05);与白花丹素高剂量组相比,白花丹素高剂量+EX-527组肾组织sirt1、FOXO1蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见表2、图1。

表1 各组24 h尿蛋白、FBG、Scr、β2-MG水平、左肾指数

表2 各组肾组织匀浆SOD、MDA、CAT、IL-1β、IL-6水平及sirt1/FOXO1通路相关蛋白表达

1～6:对照组、DN组、白花丹素低剂量组、白花丹素高剂量组、EX-527组、白花丹素高剂量+EX-527组图1 Western印迹检测各组肾组织sirt1/FOXO1 通路相关蛋白表达

2.5各组肾组织病理学变化 对照组肾脏组织肾小球、肾小管及上皮细胞结构完整,胞界清晰,排列整齐;DN组肾小球上皮细胞坏死增多、系膜基质增多、肾小球硬化,炎性细胞浸润;与DN组相比,白花丹素低、高剂量组肾小球、肾小管损伤程度减小,炎性浸润细胞减少,EX-527组肾损伤较为严重;与白花丹素高剂量组相比,白花丹素高剂量+EX-527组肾损伤严重。见图2。

2.6各组肾组织细胞凋亡情况 与对照组〔(2.35±0.28)%〕相比,DN组肾脏组织细胞凋亡率〔(20.18±2.51)%〕显著升高(q=25.594,P<0.05,n=10);与DN组相比,白花丹素低剂量组〔(16.59±2.06)%〕、白花丹素高剂量组肾脏组织细胞凋亡率〔(13.21±1.66)%〕显著降低(q=5.959、11.569,P<0.05),EX-527组凋亡率〔(25.73±3.28)%〕显著升高(q=9.212,P<0.05);与白花丹素高剂量组相比,白花丹素高剂量+EX-527组肾脏组织细胞凋亡率〔(15.94±1.97)%〕显著升高(q=4.531,P<0.05)。见图3。

图2 各组肾脏病理(PAS染色,×200)

图3 各组肾组织细胞凋亡(TUNEL染色,×200)

3 讨 论

炎症反应、氧化应激损伤贯穿DN的发生进展,生理状态下,氧自由基与抗氧化物质处于平衡,产生的ROS较快被SOD等抗氧化物质清除,MDA作为衡量脂质过氧化物化程度因子是由氧自由基攻击机体所产生,病理情况下,ROS生成速率过快,抗氧化物质难以清除,MDA与肾组织产生的炎性物质共同攻击肾脏,导致肾纤维化,破坏肾脏结构与功能。本研究构建的DN模型肾组织损伤,氧化应激、炎症反应增强,可满足实验需求。

白花丹有广泛的药用价值,祛风除湿、解毒消肿、跌倒扭伤等。白花丹素是从其根部提取的活性物质,体外实验显示,白花丹素具有抗肿瘤、调节脂质代谢等作用,周群等〔5〕研究显示,白花丹素通过ROS介导的c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路诱导舌鳞状细胞癌细胞凋亡;雷静文等〔13〕研究显示,白花丹素可降低高脂肪饮食小鼠肝脏脂质累积,降低脂肪代谢过程与糖异生相关基因表达。此外,白花丹素具有保护肾脏功能的作用,高青青等〔14〕研究显示,白花丹提取物在体外可降低高糖诱导的肾小球系膜细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6、Ⅳ型胶原蛋白(Col Ⅳ)表达;白花丹素可通过抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLRP)3/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/核因子(NF)-κB减轻IgA肾病病理损伤。24 h尿蛋白在肾脏损伤者中显著升高,是肾病人士必须检测的指标之一;肌酐(Cr)一般随尿排除,肾功能受损后Scr积聚,因此Scr是评价肾功能的良好指标;β2-MG在近端肾小管被吸收,血β2-MG升高可反映肾小球滤过功能受损〔11,15〕。本研究结果提示,白花丹素可缓解DN模型大鼠病理损伤,保护肾脏功能,其作用机制可能与抑制氧化应激、炎症反应有关。

sirt1是广泛存在与各组织细胞中,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性蛋白脱乙酰酶,可通过乙酰化转录因子及蛋白修饰的赖氨酸残基发挥作用,FOXO1是一种转录因子,可通过与sirt1启动子区域位点结合,被sirt1激活,二者共同发挥抗氧化应激作用〔16〕。Li等〔17〕研究显示,大蒜素通过激活sirt1/FOXO1途径预防C57BL/6J小鼠氧化应激与破骨细胞生成,减轻铅诱导的骨丢失。Zhu等〔18〕研究显示,红景天苷通过增强sirt1/FOXO1通路介导的自噬预防氧化低密度脂蛋白诱导的动脉粥样硬化引起的内皮损伤。本研究结果氧化应激、炎症损伤加重,提示sirt1/FOXO1通路在DN的损伤中发挥作用,抑制此通路可能加重大鼠肾损伤。白花丹素对DN大鼠肾结构、功能的缓解作用可被EX-527削弱,进一步提示了白花丹素可能通过激活sirt1/FOXO1通路,抑制氧化应激损伤,发挥对DN大鼠肾脏的保护作用。

综上所述,白花丹素可缓解DN大鼠肾脏损伤,降低炎症水平与氧化应激损伤,可能是通过激活sirt1/FOXO1通路实现的。但本研究也存在一定不足之处,仅进行了通路抑制剂处理,且仅为动物实验,仍需进一步进行细胞试验。