黄芩素通过抑制NF-κB/STAT3/ERK信号通路改善过敏性鼻炎小鼠的炎症反应

胡青 颜微微 王文广 彭凌艳

(湖北省中医院 1健康管理中心,湖北 武汉 430074;2耳鼻喉科;3儿科)

过敏性鼻炎是一种常见的呼吸系统疾病,由免疫球蛋白(Ig)E、IgG1等介导和炎症相关细胞及因子参与生成,在全球范围内具有很高的发病率,发病后往往难根治,逐渐形成慢性病状,长期影响患者的呼吸功能,对日常生活造成极大的困扰,严重时还会产生一系列并发症,引发鼻窦炎、支气管哮喘等〔1〕。过敏性鼻炎可由多种因素诱导产生,食用或吸入致敏物质、先天遗传、空气污染和体外感染均可诱导该疾病的发作,目前主要通过抗炎类治疗药物延缓发作,减轻病情〔2〕。开发具有针对性的治疗药物成为当前的重中之重。已知过敏性鼻炎受多种影响因子的调控,核转录因子(NF)-κB是调控信号转导的重要调控因子,可参与影响神经信号转导,促进炎症相关因子表达,加剧炎症反应〔3〕。信号传导与转录激活因子(STAT)3在信号转导中同样发挥重要作用,在加速神经信号转导的同时,增强炎症相关因子的表达水平〔4〕。细胞外调节蛋白激酶(ERK)表达也被证实可促进炎症因子释放,加剧炎症反应扩散〔5〕。黄芩素是一种常见的重要提取物,是黄芩中的主要有效成分,具有抗病毒、抗炎、抗血小板凝结等多种药物作用,已被证实对于炎症引发的多种疾病具有良好的治疗效果〔6〕。黄芩素可以显著抑制多种因素引发的肺部炎症,以黄芩素为主要成分的苍耳子鼻炎胶囊已被应用于治疗鼻炎〔7〕,推测黄芩素对于过敏性鼻炎具有良好的治疗效果,但仍需实验加以证实,具体的作用途径也有待进一步探索。本研究通过构建过敏性鼻炎小鼠模型,探究黄芩素是否通过调控NF-κB/STAT3/ERK信号通路参与治疗相关疾病。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 氯雷他定(国药准字H20040393)购于昆明积大制药股份有限公司,黄芩素(货号DH0024)购于成都德思特生物科技有限公司,NF-κB激活剂脂多糖(LPS,货号QN0166)购于百奥莱博生物科技有限公司,ERK激活剂DMU-212(货号HY-137977)购于MCE公司,卵清蛋白(OVA,货号LQ104622)购于酷尔化学科技有限公司,氢氧化铝(货号145300)购于上海江莱生物科技有限公司,白细胞介素(IL)-12酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(货号BMS616)购于北京诺为生物科技有限公司,血清肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA检测试剂盒(货号TW8111)购于上海通蔚科技有限公司,IL-6 ELISA检测试剂盒(货号ml063160)购于上海酶联生物科技有限公司,Diff染色试剂盒(货号LM-364D)购于上海联迈生物工程有限公司,苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(货号AR1180)购于博士德生物科技有限公司,磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(货号ab9485)、NF-κB p65抗体(货号ab239882)、NF-κB p-p65抗体(货号ab76302)、STAT3抗体(货号ab76315)、ERK抗体(货号ab32537)、p-ERK抗体(货号ab201015)购于Abcam公司,荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(7500,ABI公司),凝胶成像系统(CA-268,上海精密仪器仪表有限公司)。

1.2构建动物模型 实验动物购自河南环宇康禾生物科技有限公司〔许可证号SCXK(豫)2020-0004〕,72只SPF级BALB/c小鼠,5周龄,平均体质量(20±2)g。随即将小鼠分为健康对照组、过敏性鼻炎组、氯雷他定组、黄芩素处理组、黄芩素+ERK激活组、黄芩素+NF-κB激活组,每组各12只。除健康对照组外,其余各组于1、5、10、15 d腹腔注射OVA 2.5 mg/kg和氢氧化铝〔溶于磷酸盐缓冲液(PBS)〕50 mg/kg,健康对照组腹腔注射等剂量的生理盐水。末次注射OVA致敏5 d后,除健康对照组外,各组每日OVA鼻内激发(0.5 mg/鼻孔)1次,连续激发7 d,健康对照组不做处理。末次激发24 h后进行过敏性鼻炎症状评分〔8〕。症状评分≥5时认定为具有明显过敏性鼻炎症状,为造模成功,进行后续实验。评分标准如下:①抓挠情况:0分,无抓挠举动;1分,有抓挠现象,但不频繁;2分,出现频繁性的抓挠现象;3分,反复抓挠并摩擦。②喷嚏情况:0分,观察时间内无打喷嚏;1分,观察时间内喷嚏数少于4个;2分,观察时间内喷嚏数4～10个;3分,观察时间内喷嚏不断,喷嚏数多于10个。③鼻孔流涕情况:0分,无鼻孔流涕;1分,有鼻孔流涕现象,仅在鼻孔附近;2分,有鼻孔流涕现象,流至鼻孔下;3分,涕流满面。症状评分为各观察情况得分总和。评估结束后,氯雷他定组腹腔注射氯雷他定2 mg/kg,黄芩素处理组腹腔注射黄芩素40 mg/kg,黄芩素+ERK激活组腹腔注射黄芩素40 mg/kg和ERK激活剂DMU-212 10 mg/kg,黄芩素+NF-κB激活组腹腔注射黄芩素40 mg/kg和NF-κB激活剂LPS 20 mg/kg,健康对照组、过敏性鼻炎组腹腔注射等剂量的生理盐水。1次/d,连续注射10 d,末次注射24 h后进行过敏性鼻炎症状评分。

1.3炎性细胞及相关因子检测 过敏性鼻炎症状评分结束后麻醉各组小鼠,从气管处插入导管直至鼻咽部,用1 ml生理盐水清洗鼻腔,收集液体,多次重复操作后收集鼻腔灌洗液,4 ℃ 6 000 r/min离心5 min,收集上层清液用于检测炎症相关因子水平。按照ELISA试剂盒说明书检测各组鼻腔灌洗液中IL-12、TNF-α、IL-6水平。细胞沉淀重悬于PBS中,按照Diff染色试剂盒说明书方法进行染色,置于显微镜下利用血球计数法观察并计数,记录不同类型细胞数。

1.4染色观察鼻黏膜组织病理学变化 收集鼻腔灌洗液后迅速处死各组小鼠,剪下各组鼻组织,剥离鼻黏膜组织,部分用4%多聚甲醛固定,部分剪碎后液氮处理研磨成粉末,冻存于冰箱备用。组织固定24 h后取出,不同浓度酒精脱水处理,石蜡常规包埋制作切片,厚度为4 μm,脱蜡至水后按照HE染色试剂盒说明书染色,酒精再次脱水处理,中性树脂封片,置于显微镜下观察实验结果。

1.5鼻黏膜组织NF-κB、STAT3、ERK蛋白检测 取出冻存备用的鼻黏膜组织粉末,加入蛋白裂解液后振荡,充分裂解蛋白,加入蛋白提取液提取总蛋白并检测浓度,与上样缓冲液混合后加热变性,加入凝胶孔道中电泳跑胶,取出经半干转膜仪转膜,脱脂牛奶封闭2 h,加入一抗(GAPDH抗体、NF-κB p65抗体、ERK抗体、NF-κB p-p65抗体、p-ERK抗体,1∶1 000),4 ℃孵育过夜。Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)清洗3次后加入二抗(1∶400),室温下孵育40 min,TBST清洗3次,混合发光试剂A液和B液,均匀倒于膜上,短暂处理,取出后擦干多余水分,置于Syngene光密度扫描系统上扫描,分析条带灰度。

1.6统计学方法 采用SPSS22.0软件行单因素方差分析(one-way ANOVA)和SNK-q检验。

2 结 果

2.1黄芩素对过敏性鼻炎小鼠炎性细胞及相关因子含量的影响 与健康对照组相比,过敏性鼻炎组鼻腔灌洗液中IL-12、TNF-α、IL-6含量和血清中IgE、IgG1含量显著升高,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量显著升高(P<0.05);与过敏性鼻炎组相比,氯雷他定组、黄芩素处理组鼻腔灌洗液中IL-12、TNF-α、IL-6含量和血清中IgE、IgG1含量显著降低,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量显著降低(P<0.05);与黄芩素处理组相比,黄芩素+ERK激活组、黄芩素+NF-κB激活组鼻腔灌洗液中IL-12、TNF-α、IL-6含量和血清中IgE、IgG1含量显著升高,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量显著升高(P<0.05);氯雷他定组与黄芩素处理组鼻腔灌洗液中以上指标无显著差异(P>0.05),见表1、表2。

表1 各组鼻腔灌洗液IL-12、TNF-α、IL-6和血清IgE、IgG1含量比较

表2 各组鼻腔灌洗液中不同细胞数量比较

2.2治疗前后过敏性鼻炎症状评分比较 治疗前后,与健康对照组相比,过敏性鼻炎组过敏性鼻炎症状评分显著升高(P<0.05)。与治疗前相比,治疗后过敏性鼻炎组、氯雷他定组、黄芩素处理组、黄芩素+ERK激活组、黄芩素+NF-κB激活组过敏性鼻炎症状评分显著降低(P<0.05)。治疗后,与过敏性鼻炎组相比,氯雷他定组、黄芩素处理组过敏性鼻炎症状评分显著降低(P<0.05);与黄芩素处理组相比,黄芩素+ERK激活组、黄芩素+NF-κB激活组过敏性鼻炎症状评分显著升高(P<0.05);氯雷他定组与黄芩素处理组过敏性鼻炎症状评分无显著差异(P>0.05),见表3。

2.3黄芩素对过敏性鼻炎小鼠鼻黏膜组织NF-κB、STAT3、ERK蛋白表达的影响 与健康对照组相比,过敏性鼻炎组鼻黏膜组织NF-κB p-p65/NF-κB p65、p-STAT3/STAT3、p-ERK/ERK显著升高(P<0.05);与过敏性鼻炎组相比,氯雷他定组、黄芩素处理组鼻黏膜组织上述指标显著降低(P<0.05);与黄芩素处理组相比,黄芩素+ERK激活组鼻黏膜组织p-ERK/ERK显著升高,黄芩素+NF-κB激活组鼻黏膜组织NF-κB p-p65/NF-κB p65、p-STAT3/STAT3显著升高(P<0.05);氯雷他定组与黄芩素处理组鼻黏膜组织以上指标无显著差异(P>0.05),见表3、图1。

表3 各组治疗前后过敏性鼻炎症状评分及鼻黏膜组织NF-κB p-p65/NF-κB p65、p-STAT3/STAT3、p-ERK/ERK比较

1～6:健康对照组、过敏性鼻炎组、氯雷他定组、黄芩素处理组、黄芩素+ERK激活组、黄芩素+NF-κB激活组图1 各组鼻黏膜组织NF-κB、STAT3、ERK、 NF-κB p-p65、p-STAT3、p-ERK蛋白表达

2.4黄芩素对过敏性鼻炎小鼠鼻黏膜组织病理变化的影响 健康对照组鼻黏膜组织完整,上皮细胞完好,细胞间均匀排列,无炎性细胞浸润;过敏性鼻炎组鼻黏膜组织具有明显病理学变化,上皮组织明显缺损,细胞间间隙扩大,有大量炎性细胞浸润;氯雷他定组、黄芩素处理组鼻黏膜组织逐渐恢复,上皮组织增生,细胞间隙缩小,仅有少量炎性细胞存在;与黄芩素处理组相比,黄芩素+ERK激活组、黄芩素+NF-κB激活组鼻黏膜组织恢复较慢,上皮细胞数量较少,细胞间仍有大量空隙,充斥着大量炎性细胞,见图2。

图2 各组鼻黏膜组织病理(HE染色,×400)

3 讨 论

过敏性鼻炎主要指由IgE、IgG1介导引发的炎症反应,环境中存在的多种致敏物质均可与特异性的IgE抗体结合,两者进一步发生反应引发机体不适,而IgG1在过敏性炎症中发挥重要作用,与炎症因子结合加重炎症反应〔9〕。过敏性鼻炎伴随着机体自身的免疫调节作用,引起阵发性喷嚏、鼻痒、鼻孔流涕等症状,可根据这些症状评判过敏性鼻炎的严重程度〔10〕。在自身免疫调节过程中炎症因子含量激增,细胞因子充斥在鼻黏膜附近,增强炎症反应,加重患者病情。因此在评估表面症状的同时,还可根据炎症反应检测判断病情〔11〕。本研究表明,构建模型后小鼠存在明显的炎症反应,且伴随明显的过敏性鼻炎症状,构模成功。

中医药治疗近年来成为热点话题,其中大部分中医药材具有良好的抗炎消菌作用,且无副作用,作用明显且药效持久。黄芩素是常见中药材黄芩中的主要有效成分,被证实具有显著的抗炎作用〔12〕。黄芩素可参与调控肺炎小鼠体内炎症相关因子含量,减少肺泡灌洗液中炎性细胞数量,抑制肺部炎症反应从而缓解病情〔13〕。黄芩素与柴胡混合使用可减轻头痛,清除病菌,已被应用于治疗鼻窦炎等多种呼吸性疾病〔14〕。结合以上研究,推测黄芩素可参与减轻过敏性鼻炎炎症反应,缓解病情,并选用对鼻炎具有良好治疗效果的氯雷他定作为阳性对照评估黄芩素的治疗效果〔15〕。本研究表明,黄芩素可以显著减轻炎症反应,改善过敏性鼻炎症状,缓解病情。有文献指出,过敏性鼻炎会导致鼻黏膜组织充斥大量炎症细胞,破坏组织结构,加剧炎症反应的同时激活体内免疫反应,导致鼻孔流涕不止〔16〕。因此对于鼻黏膜组织的病理学观察是探究相关疾病致病机制和恢复状况的重要依据。本研究发现,过敏性鼻炎组小鼠鼻黏膜组织具有明显病理学变化,有大量炎性细胞浸润,而氯雷他定和黄芩素处理后,鼻黏膜组织逐渐恢复,仅有少量炎性细胞存在,进一步验证黄芩素的作用,但具体的作用途径有待探索。

有研究指出,NF-κB是调控炎症反应的重要调控因子,参与介导多种疾病的炎症反应。NF-κB在过敏性鼻炎患者体内高表达,协助诱导产生大量炎症因子〔17〕。NF-κB可进一步促进下游STAT3蛋白的表达和激活,如健脾益肺汤可通过调控NF-κB表达,进一步抑制STAT3的表达,缓解哮喘大鼠的肺部炎症〔18〕;新鱼腥草素钠也可抑制相关通路缓解小鼠炎症性肠病〔19〕。ERK同样参与炎症反应的调控,研究发现促红细胞生成素介导ERK的表达,抑制其激活,从而缓解心肌梗死大鼠的炎症反应,保护心肌细胞〔20〕。此外,黄芩素被证实可降低ERK、NF-κB、STAT3的磷酸化水平,抑制炎性细胞活性,从而改善小鼠肠炎〔21〕。因此推测黄芩素通过调控NF-κB/STAT3/ERK信号通路发挥作用。本研究表明,黄芩素很可能通过调控NF-κB/STAT3/ERK信号通路发挥作用。本实验结果证实黄芩素通过抑制NF-κB/STAT3/ERK信号通路蛋白的激活发挥作用。

综上,黄芩素通过调控NF-κB/STAT3/ERK信号通路,抑制NF-κB p65、STAT3、ERK蛋白磷酸化,缓解炎症反应,加速小鼠鼻黏膜组织恢复,改善过敏性鼻炎症状,从而缓解病情。黄芩素是否通过调控其他通路间接参与影响过敏性鼻炎,仍需要进一步的实验加以说明。