中药通心络胶囊对糖尿病足大鼠nephrin、podocin水平、巨噬细胞M1表型及VEGF蛋白的作用

李会玉 孔青 郝彦雷

(河北以岭医院,河北 石家庄 050090)

糖尿病足(DF)是常见的糖尿病相关并发症,发病机制与血管损伤、神经系统异常及机体感染相关〔1〕。近些年,中药在DF的治疗中逐渐发挥重要作用,认为采用益气活血类药物可通过加快血管新生进而抑制DF炎症,改善皮肤组织溃疡。中医认为DF属于消渴病继发病证,可以采用活血化瘀、清热泻火、补肾、抗炎的中药治疗,通心络胶囊包括多种中药材,具有益气活血的功效〔2〕。神经功能、肾功能不全等会引起DF,DF溃疡后会产生较多毒性物质,被人体吸收之后不能及时代谢排出体外,反过来就会加重肾脏负担。nephrin、podocin是足细胞裂孔隔膜相关蛋白,nephrin主要在肾小球足细胞中表达,但是当发生病理改变后其表达降低,因此检测其表达可作为肾小球足细胞损伤的重要标志〔3〕。podocin是一种支架蛋白,其表达异常时会导致蛋白尿增多等肾脏损伤〔4〕。单核巨噬细胞是具有调节炎症及免疫功能的因子,当皮肤出现损伤时M1型巨噬细胞增加,M2 型巨噬细胞减少,导致促炎抗炎免疫失衡,可加快溃疡程度〔5,6〕。血管内皮生长因子(VEGF)具有调节微循环,加快皮肤组织修复的作用〔7〕。本实验研究中药通心络胶囊对糖尿病足大鼠nephrin,podocin 水平、巨噬细胞M1表型及VEGF蛋白的作用。

1 材料和方法

1.1实验动物 SPF级健康SD大鼠50只,体质量200～300 g,由北京博尔西公司提供〔生产许可证号:SCXK(京)-2019-0124〕,常规饲养,温湿度适应,自由取食和水。本次实验已通过河北以岭医院医学伦理委员会审批,批号:Y-2019-01-25。

1.2药物 通心络胶囊(石家庄以岭药业股份有限公司,批号:20090430),由人参、水蛭、全蝎、蝉蜕、赤芍、土鳖虫、檀香、降香、酸枣仁、乳香、冰片等组成,用1.47 g生药/g,0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制,4 ℃保存。

1.3实验试剂 聚合酶链反应(PCR)试剂盒(广州市百菱生物科技有限公司,货号:PM008),苏木素-伊红(HE)染色液(上海西格生物科技有限公司,货号:XG-X6822),PCR仪(上海三崴医疗设备公司,型号:FACSVia),CD68、精氨酸酶(ARG)-1、CD163酶、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)一抗(上海沪鼎生物科技有限公司,编号:B-02142),VEGF、缺氧诱导因子(HIF)-1α一抗(北京百奥莱博生物科技有限公司,货号:YT848-MEU),辣根过氧化物酶二抗(上海李记生物科技有限公司,货号:AP31L014)。

1.4模型建立及干预 50只大鼠中随机抽取10只作为健康组进行对照,剩余大鼠按照参考文献〔8〕建立动物模型,所有大鼠适应环境1 w后采用高脂饲料喂养30 d,禁食24 h,将链脲佐菌素(STZ)溶于0.1 mol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH4.2)溶液中,配成浓度为1%的溶液,单次腹腔注射40 mg/kg,后采用普通饲料喂养3 d,当外周空腹血糖≥16.7 mmol /L 为糖尿病大鼠造模成功〔9〕。普通饲料喂养30 d,采用3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,YLS-5Q 超级控温烫伤仪0.5 kg压力及80 ℃下作用4 s,烫伤处皮肤出现苍白、肿胀、破溃等为糖尿病足动物建模成功,健康组不予特殊处理。采用随机数字表法将40只建模成功大鼠分为模型组,通心络低、中、高剂量组,每组10只。健康组、模型组给予2 ml 生理盐水灌胃;通心络低、中、高剂量组分别给予通心络胶囊0.50、0.75、1.00 g/kg灌胃,1次/d,共12 w。

1.5大鼠足部病理形态 取各组大鼠,麻醉后处死取足部组织及肾脏组织,10%甲醛固定组织,沿着纵方向进行切片,切片4 μm,低温保存以便后续试验。10%硝酸脱钙液进行脱钙,采用HE及Masson 染色,观察病理形态及愈合情况、炎性细胞、新生胶原分布及新生管腔等情况。

1.6RT-PCR检测nephrin、podocin表达 根据Trizol试剂说明从细胞系中提取和纯化总RNA,反转录试剂盒合成cRNA,PCR仪进行扩增,SYBR Green PCR Master mix 试剂盒检测nephrin、podocin表达。RT-PCR条件:95 ℃预变性30 s, 95 ℃ 变性5 s,60 ℃ 31 s,40个循环。以β-actin为内参,用2-ΔΔCt法计算Nephrin、podocin相对表达。引物序列:Nephrin:上游引物:5′-CCAGAGTGGACGAACTATATTGGA-3′,下游:5′-GACCAGTAACTGCCCGTTATCC-3′;podocin:上游引物:5′-CCTTTCCATGAGGTGGTAACCA-3′,下游:5′-GGATGGCTTTGGACACATGAG-3′;β-actin上游引物:5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′,下游:5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′。

1.7多重免疫荧光检测伤口组织中 M1 型和 M2 型巨噬细胞数量 取各组足部创面组织,石蜡切片(3 μm)磷酸盐冲洗15 min,反复2次,0.2%～0.5%的细胞通透剂通透,5%血清封闭60 min,加入一抗CD68、ARG-1、CD163 和iNOS孵化过夜,后采用二抗封片。Strata Quest 软件计算,计算M1 和 M2 型巨噬细胞数量占总巨噬细胞数的百分比(%)。

1.8Western印迹检测细胞中VEGF、HIF-1α蛋白表达水平 取各组细胞,胰蛋白酶消化,离心,取上清液。放入样孔中,进行电泳实验。电泳后将样品转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,清洗样品,将其放置在Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)溶液中室温下混匀10 min,封闭蛋白1 h后,将其置于4 ℃环境孵育过夜。加入一抗VEGF、HIF-1α(1∶500),TBST冲洗,4 ℃孵育24 h,加入二抗(1∶2 000)孵育40 min,再采用TBST清洗蛋白样本,后凝胶成像分析蛋白含量。

1.9检测DF大鼠足部溃疡面积 采用黑丝记号笔沿着大鼠溃疡边缘画出轮廓,采用相机拍照,均由同一医生完成,完成后导入计算机,应用ImageJ1.46医学图像分析软件进行分析。

1.10统计学分析 采用GraphPad Prism8.0软件进行LSD-t检验。

2 结 果

2.1大鼠足部病理形态 HE染色:模型组溃疡组织存在大量炎症细胞表达,且胶原纤维组织薄弱及组织排列稀疏;与模型组相比,通心络低、中、高剂量组足部病理形态有所改善,且以高剂量组最显著。Masson 染色:模型组创面溃疡未完全愈合,且存在大量炎症因子,与模型组相比,通心络各剂量组有所改善,见图1。

图1 各组足部病理形态(×200)

2.2各组nephrin、podocin表达 HE染色:健康组肾脏组织排列清晰,模型组肾小球萎缩,炎性细胞浸润。与模型组相比,各剂量通心络组肾组织病理显著改善,见图2。健康组nephrin、podocin表达水平显著高于模型组(P<0.05);与模型组相比,通心络低剂量组nephrin、podocin表达显著升高(P<0.05);与通心络低剂量组相比,通心络中剂量组nephrin、podocin表达显著升高(P<0.05);与通心络中剂量组相比,通心络高剂量组nephrin、podocin表达显著升高(P<0.05),见表1。

图2 各组肾组织病理形态(HE染色,×100)

表1 各组Nephrin、podocin、VEGF、HIF-1α及CD68+、iNOS+、ARG-1、CD163+水平对比

2.3创面中MI、M2型巨噬细胞数量 各组CD68+表达差异无统计学意义(P>0.05)。与健康组相比,模型组iNOS+表达显著增加(P<0.05);与模型组相比,通心络低、中、高剂量组iNOS+表达显著降低,且以高剂量组效果最显著(P<0.05)。与健康组相比,模型组ARG-1表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,通心络低、中、高剂量组ARG-1表达显著升高,且以高剂量组效果最显著(P<0.05)。与健康组相比,模型组CD163+表达显著降低(P<0.05);与模型组相比, 通心络低、中、高剂量组CD163+表达显著升高,且以中剂量组效果最显著(P<0.05)。与健康组相比,模型组M1型巨噬细胞显著增加、M2型巨噬细胞显著减少(P<0.05);与模型组相比,通心络各剂量组M1型巨噬细胞显著减少、M2型巨噬细胞显著增加,且以高剂量组效果最显著(P<0.05),见表1、图3。

图3 各组MI、M2型巨噬细胞数量(免疫荧光染色,×200)

2.4各组VEGF、HIF-1α蛋白表达 健康组VEGF、HIF-1α表达显著高于模型组(P<0.05),模型组VEGF、HIF-1α表达显著低于通心络低剂量组(P<0.05),通心络低剂量组VEGF、HIF-1α表达显著低于通心络中剂量组(P<0.05),通心络中剂量组VEGF、HIF-1α表达显著低于通心络高剂量组(P<0.05),见表1、图4。

2.5大鼠足部溃疡面积 模型组足部溃疡面积〔(0.81±0.05)cm2〕高于通心络低剂量组〔(0.54±0.07)cm2〕,差异有统计学意义(t=9.93,P<0.05)。与通心络低剂量组相比,通心络中剂量组溃疡面积〔(0.42±0.05)cm2〕显著减少(t=4.41,P<0.05)。与通心络中剂量组相比,通心络高剂量组溃疡面积〔(0.23±0.02)cm2〕显著减少(t=11.16,P<0.05)。

1～5:健康组,模型组,通心络低、中、高剂量组图4 Western印迹检测各组VEGF、HIF-1α水平

3 讨 论

缺氧是血管形成损伤的重要原因,缺氧环境下VEGF 表达降低,HIF-1α的反式激活,促使血管生成能力减慢,进而降低血管再生,导致糖尿病患者伤口愈合延迟〔10〕。原因可能在于HIF-1α能够与活性氧簇(ROS)结合后提高对乙二醛酶(GLO)Ⅰ修饰作用,破坏HIF-1α稳定性,进而导致血管生成能力减慢,延迟伤口愈合。研究表明〔11〕,糖尿病组织缺氧缺血,机体HIF-1α 表达下调,VEGF表达抑制导致血管新生受阻,组织持续性循环障碍,加重局部组织缺氧缺血,导致坏死。通过动物及临床研究表明,DF上调VEGF、HIF-1α可显著改善创面愈合〔12,13〕。中医将DF归属于“消渴”“脱疽”病的范畴,发病机制与先天禀赋不足、情志失衡及劳欲过度相关〔14,15〕。通心络胶囊是由多味中药组成的中药制剂,其中人参有滋补益气及增加免疫力的功效,人参皂苷是主要活性成分,可加快糖分氧化,提高琥珀酸脱氢酶表达可加快胰岛素释放,故发挥抗血糖作用。通心络胶囊中水蛭、全蝎、蝉蜕、蜈蚣、冰片均可发挥活血、止痛、祛风等作用。研究发现〔16〕通心络胶囊可通过提高DF缺血组织中VEGF表达,显著加快血管新生。本研究与上述研究结论相似,提示通心络胶囊可通过促进VEGF、HIF-1α表达,促进DF大鼠创面愈合。

DF溃疡后会产生较多毒性物质,被人体吸收之后不能及时代谢排出体外,反过来就会加重肾脏负担。nephrin、podocin是肾小球足细胞损伤的标志。足细胞主要存在于深肾脏肾小球基底膜的外侧,其损伤会提高蛋白尿,进而导致肾小球硬化发展为终末期肾脏疾病。研究表明〔17〕,上调 nephrin、podocin 表达可有效保护肾脏。本研究结果与上述结论相似,表明通心络胶囊可显著改善DF大鼠肾病理损伤,并提高足细胞数目而增加肾脏保护。研究机制可能在于通心络胶囊主要成分人参可发挥抗氧化应激,改善肾小球基底膜增厚,提高足细胞数目而改善肾组织病理损伤的作用〔18〕。

巨噬细胞极化主要分为M1及M2细胞极化,细胞因子可与巨噬细胞表面受体结合后,调节多种生物学效果。M1主要为促炎症作用,M2主要为抗炎症作用,在DF中M1型巨噬细胞被激活可激活致炎因子而导致组织损伤,而M2型巨噬细胞呈现低表达抗炎症作用弱化〔19,20〕。DF小鼠模型中,在晚期糖基化的作用下,M2型巨噬细胞表达降低导致VEGF表达下调,溃疡组织中呈现高炎症表达,导致不愈合表型〔21〕。脂肪组织源性干细胞(ADSCs)移植到大鼠皮肤缺损创面中,促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,抗炎的同时可加快溃疡组织修复〔22〕。本研究提示,通心络胶囊通过抑制M1型巨噬细胞数目的增加,减少炎症浸润,促进创面愈合,与上述结论相似。

综上,通心络胶囊可促进VEGF/HIF-1α表达,使巨噬细胞向M1极化,促进创面愈合,提高nephrin/podocin表达水平,减轻由DF导致的肾脏负担。