miR-124通过抑制TLR4/NF-κB/CCL2对脑梗死大鼠神经元凋亡的影响

陈笛 温昌明 李祥欣 孙军 高军 张在行 张东焕 张保朝

(南阳市中心医院,河南 南阳 473000)

脑梗死(CI)是一种多发于中老年人群的常见急性脑血管疾病,临床上称为缺血性脑卒中,发病急,可在短时间内引发序惯性脑损伤,严重损害神经功能,患者致死、致残比例均较高〔1,2〕。CI起病急且病情进展快,往往错过最佳治疗窗口,临床治愈率低,预后不佳,如今其患病人数逐年增加,已成为中老龄人群残疾及死亡的主要原因〔3,4〕。脑缺血损伤发生时,因供血受阻引起缺血部位脑组织坏死,激活炎症级联反应,而血液再灌注时,会促进炎症进展,进一步加重脑损伤,因而抑制神经炎症是减轻缺血再灌注脑损伤、修复神经功能的有效手段〔5,6〕。Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB是机体调控细胞增殖、细胞外基质代谢、过氧化和炎症反应的主要信号途径〔7〕,抑制TLR4/NF-κB信号激活可降低炎性因子表达,增强抗氧化活性,减轻脑组织炎症和氧化应激损伤,改善急性CI患者神经功能〔8〕。CC类趋化因子配体(CCL)2是TLR4/NF-κB途径的下游信号因子,下调TLR4/NF-κB信号可降低CCL2的表达,抑制炎症级联反应,保护脑组织免于缺血损伤,因而TLR4/NF-κB/CCL2信号可作为CI的重要治疗靶点〔9〕。微小RNA (miR)-124是介导阿尔茨海默病、创伤性脑损伤等神经系统疾病发生与进展的重要因子,过表达miR-124-3p可减轻重复性轻度创伤性脑损伤小鼠神经退行性病变,改善其认知功能〔10〕,并可减少胶质瘢痕的形成,促进CI恢复〔11〕,另有研究显示,miR-124可通过下调TLR4/NF-κB/CCL2通路激活程度减轻高氧诱导的过度炎症,抑制肺上皮细胞凋亡〔12〕。因而推测miR-124可能通过抑制TLR4/NF-κB/CCL2信号减轻脑缺血损伤所致的神经元凋亡,本文通过建立CI大鼠模型,对此进行探究。

1 材料与方法

1.1动物 SD大鼠,雄性,体质量200～230 g,SPF级,购于上海昇敞生物科技有限公司〔生产许可SCXK(沪)2021-0002〕。在南阳市中心医院屏障环境动物房适应饲养,在动物笼中喂养,一笼5～6只,平均温度(23±2.5)℃,平均湿度(55±5)%,照明12 h/12 h明暗循环交替,1 w后用于实验。

1.2主要试剂及仪器 miR-124 agomir、TLR4过表达质粒、miR-124 agomir阴性对照、空载质粒、miR-124 与U6引物、一步法反转录荧光定量试剂盒(货号B639277-0100)购于生工生物工程(上海)股份有限公司;大鼠白细胞介素(IL)-17酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号SEKR-0007)、三苯基氯化四氮唑(TTC,货号T8170)、大鼠环氧化酶(COX)-2 ELISA试剂盒(SEKR-0075)、高效RIPA裂解液(货号R0010)、总RNA提取试剂盒(货号R1200)购于北京索莱宝科技有限公司;活性氧(ROS)测定试剂盒(货号E004-1-1)、TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(货号G001-1-1)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白质定量检测试剂盒(货号C503021)购于南京建成生物工程研究所有限公司;兔源Anti-β-actin一抗(货号ab8227)、兔源Anti-CCL2一抗(货号ab7202)、兔源Anti-B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)一抗(货号ab194583)、兔源Anti-增殖细胞核抗原(PCNA)一抗(货号ab18197)、兔源Anti-NF-κB p65一抗(货号ab16502)、兔源Anti-Bcl-2相关X蛋白(Bax)一抗(货号ab32503)、兔源Anti-TLR4一抗(货号ab214185)、羊抗兔二抗(货号ab150077)购于美国Abcam公司等。

冰冻切片机、光学显微镜-型号CM1520、DMI3000B购于德国Leica公司;电泳仪、全段酶标仪、化学发光成像分析系统、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪、转膜仪-型号PowerPac Universal、1681135、ChemiDoc XRS+、CFX96 Touch 1855196、Trans-Blot Trubo,购于美国Bio-Rad公司等。

1.3制备CI大鼠模型及分组给药 参照文献〔13〕的方法制备大鼠CI模型:大鼠禁食12 h,禁水4 h,腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠(质量分数2%)溶液,大鼠深度麻醉后仰卧固定在手术台上,于颈部脱毛备皮、酒精消毒,切开颈部皮肤逐层分离肌肉组织,找到并游离左侧颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉,结扎颈外动脉后以特定线栓插入其中,经颈内动脉到达大脑中动脉,阻断中动脉血流2 h,然后拔出线栓,恢复血流,再灌注24 h,即可完成造模。接着观察大鼠行为,采用Zea Longa分级法〔14〕做神经功能缺损状况评分:大鼠行为正常,0分;大鼠左前肢伸展不完全,1分;提尾大鼠时,其向左侧转圈,2分;大鼠行走不便,向左侧倾倒,3分;大鼠不能行走,几乎无意识,4分,评分1～3分表示建模成功,共成功造模60只。以随机数表法将CI大鼠平均分为5组:模型组、miR-124 agomir组、TLR4过表达质粒组、miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组,另取12只大鼠只分离颈动脉,不做其他操作,作为假手术组。miR-124 agomir、TLR4过表达质粒、miR-124 agomir阴性对照、空载质粒浓度参照说明书设置,给药处理组均于造模完成后,马上以尾静脉注射的方法干预给药;模型组和假手术组尾静脉注射等量0.9%氯化钠溶液,各组均每周给药1次,共给药处理2 w。

1.4检测神经功能 于造模完成2 w后观察大鼠行为,按照1.3中的Zea Longa分级法对其神经功能缺损状况进行评分。

1.5检测CI情况及收集标本 神经功能缺损评分完成后,按照1.3中方法麻醉各组大鼠,抽取颈动脉血离心15 min(1 000 r/min,4 ℃),吸出上清分组标记后保存在-80 ℃;断头取出大脑,每组随机选6只大鼠的大脑沿冠状面切开后孵育TTC溶液,对其梗死部位进行染色,以多聚甲醛溶液固定后拍照,采用Image pro软件分析图片,计算CI面积=全脑梗死面积/全脑片面积×100%。各组剩余的6只大鼠大脑清洗后,各取0.4 g脑组织保存在液氮中;再次各取0.5 g脑组织制为匀浆液后离心20 min(3 000 r/min,4 ℃),以BCA试剂盒测量上清中总蛋白浓度,分组标记,保存在-80 ℃备用;剩余脑组织包埋、沉糖、速冻(液氮,1 min)成块、切片备用。

1.6检测海马神经元凋亡情况 取1.5中脑组织切片,选出其中具有完整海马结构的,浸入预冷的丙酮中固定,TUNEL染色,显微镜下观察,选任意3个视野拍照,以Image pro软件分析图片,计算神经元凋亡率=凋亡神经元细胞数/总细胞数×100%。

1.7检测血清ROS及炎症因子COX-2、IL-17水平 取1.5中血清,经冰水浴解冻后,以试剂盒测定其中ROS及炎症因子COX-2、IL-17水平,具体步骤依照说明书指导进行。

1.8检测脑组织miR-124表达 取1.5中保存在液氮中的脑组织块,以试剂盒提取其中总RNA后,进行一步法反转录荧光定量PCR扩增实验,具体步骤与反应条件设定依照说明书指导进行,miR-124的内参基因选择U6,采用2-ΔΔCt算法对数据进行分析后得到其相对表达量,引物序列:miR-124正向5′-GCGCTGGAGGAGAAGGAAG-3′,反向5′-GCTGTCAACGATACGCTACG-3′;U6正向5′-CGCTTCGGCA GCACATATAC-3′,反向5′-AAATATGGAACGCTTC ACGA-3′。

1.9检测大鼠脑组织凋亡与TLR4/NF-κB/CCL2通路相关蛋白表达 取1.5中的各组脑组织蛋白样品液,经冰水浴解冻后各取20 μg蛋白,经变性,上样,电泳,湿转,可将其按分子量大小于硝酸纤维素膜上分离开,然后封闭其非特异位点,孵育一抗(Bcl-2、Bax、β-actin、TLR4、NF-κB、PCNA、CCL2),孵育二抗,显影,拍照,以Image pro软件分析蛋白图片,对其灰度值进行定量后统计分析,最终得到各组蛋白相对表达量。

1.10统计学分析 采用SPSS24.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组神经功能缺损情况检测 与假手术组比较,模型组、miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组神经功能缺损评分显著升高(P<0.05)。与模型组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组分别比较,miR-124 agomir组神经功能缺损评分均显著降低(P<0.05),TLR4过表达质粒组神经功能缺损评分均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组神经功能缺损评分无显著变化(P>0.05)。见表1。

2.2各组血清ROS及炎症因子COX-2、IL-17水平的检测结果 与假手术组比较,模型组、miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组血清ROS及炎症因子COX-2、IL-17水平显著升高(P<0.05)。与模型组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组分别比较,miR-124 agomir组血清ROS及炎症因子COX-2、IL-17水平均显著降低(P<0.05),TLR4过表达质粒组血清ROS及炎症因子COX-2、IL-17水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组大鼠血清ROS及炎症因子COX-2、IL-17水平无显著变化(P>0.05)。见表1。

表1 各组神经功能缺损评分、血清ROS及炎症因子COX-2、IL-17水平比较

2.3各组CI情况的检测结果 与假手术组比较,模型组、miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组CI面积显著升高(P<0.05)。与模型组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组分别比较,miR-124 agomir组CI面积均显著降低(P<0.05),TLR4过表达质粒组CI面积均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组CI面积无显著变化(P>0.05)。见图1、表2。

2.4各组脑组织miR-124与凋亡蛋白表达水平的检测 与假手术组比较,模型组、miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组大鼠脑组织miR-124 mRNA与Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组分别比较,miR-124 agomir组脑组织miR-124与Bcl-2蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),Bax表达水平均显著降低(P<0.05),而TLR4过表达质粒组脑组织miR-124与Bcl-2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),Bax表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组大鼠脑组织miR-124与Bcl-2、Bax蛋白表达水平无显著变化(P>0.05)。见表2、图2。

1～6:假手术组、模型组、miR-124 agomir组、TLR4过表达质粒组、miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组;图2～4同图1 TTC染色观察各组CI情况

表2 各组CI面积及脑组织miR-124与凋亡蛋白相对表达比较

图2 Western印迹检测各组脑组织凋亡蛋白表达

2.5各组海马神经元凋亡率的检测 与假手术组比较,模型组、miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组海马神经元凋亡率显著升高(P<0.05)。与模型组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组分别比较,miR-124 agomir组海马神经元凋亡率均显著降低(P<0.05),TLR4过表达质粒组海马神经元凋亡率均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组大鼠海马神经元凋亡率无显著变化(P>0.05)。见图3、表3。

图3 各组海马神经元凋亡(TUNEL染色,×200)

2.6各组脑组织TLR4/NF-κB/CCL2通路蛋白表达的检测 与假手术组比较,模型组、miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组脑组织TLR4、核内NF-κB p65、CCL2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组、miR-124 agomir+TLR4过表达质粒组分别比较,miR-124 agomir组脑组织TLR4、核内NF-κB p65、CCL2通路蛋白均显著降低(P<0.05),TLR4过表达质粒组大鼠脑组织TLR4、核内NF-κB p65、CCL2通路蛋白均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-124 agomir阴性对照+空载质粒组脑组织TLR4、核内NF-κB p65、CCL2蛋白表达水平无显著变化(P>0.05)。见表3、图4。

表3 各组凋亡率及脑组织TLR4/NF-κB/CCL2通路蛋白相对表达比较

图4 Western印迹检测各组脑组织TLR4/NF-κB/ CCL2通路蛋白表达

3 讨 论

本文采用线栓闭塞大脑中动脉法建立CI大鼠模型,结果显示,造模大鼠CI面积、血清ROS及炎症因子COX-2、IL-17水平显著升高,引发强烈的脑组织炎症,导致脑组织抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低,促凋亡蛋白Bax表达显著增加,引起海马神经元大量凋亡,造成神经功能缺损,揭示CI模型建立成功。

CI患者脑组织的缺血缺氧及血液再灌注均会显著增强促炎细胞因子表达,降低抗炎细胞因子表达,激活炎症级联反应并促进其进展,进而导致严重的脑损伤,抗炎治疗是减轻CI临床症状的有效方法〔6,15〕。TLR4是重要的炎症调节分子,可通过激活NF-κB信号,促进CCL2表达,参与介导结肠炎、变应性鼻炎、抑郁等炎症相关疾病的发病过程,下调TLR4/NF-κB信号通路表达可减少炎性因子表达及炎症细胞数量,有效减轻结肠炎症及变应性鼻炎小鼠症状〔16,17〕,并抑制急性CI患者脑组织炎症,进而改善患者神经功能损伤〔8〕。抑制TLR4/NF-κB信号还可下调CCL2表达,抑制炎症级联反应激活,减轻神经炎症,缓解脑缺血损伤〔9,18〕。由此可知,TLR4/NF-κB/CCL2信号是CI的重要治疗靶点。miR-124是一种重要的神经保护因子,可显著减少脑缺血后梗死面积,减轻缺血性脑损伤并促进神经元存活〔19〕,并可改善脑卒中后的脑组织修复〔11〕。研究显示,miR-124可调控TLR4信号传导,可通过抑制TLR4/NF-κB/CCL2信号激活进而增强抗炎介质表达,阻止炎症进展〔12,20〕。因此推测抑制TLR4/NF-κB/CCL2信号可能是miR-124改善CI脑损伤的分子机制。本文结果显示,CI模型大鼠脑组织miR-124表达水平显著降低,TLR4、NF-κB p65、CCL2蛋白表达水平显著升高。以miR-124 agomir上调CI模型大鼠miR-124表达,可降低其脑组织Bax、TLR4、核内NF-κB p65、CCL2蛋白表达,降低CI面积,减少活性氧及促炎因子合成释放,抑制脑组织炎症,减轻海马神经元凋亡及神经功能缺损症状。而以TLR4过表达质粒上调CI模型大鼠TLR4表达,起到相反作用,与miR-124 agomir合用可减弱过表达miR-124抑制CI大鼠脑组织炎症及海马神经元凋亡的功效,逆转其对大鼠神经功能缺损的修复作用,表明miR-124可通过抑制TLR4/NF-κB/CCL2信号减轻CI大鼠脑损伤,修复其神经功能。

综上所述,miR-124可通过下调TLR4/NF-κB/CCL2通路蛋白表达,减少炎性细胞因子及活性氧的产生释放,阻止炎症级联反应激活,抑制CI大鼠海马神经元细胞凋亡,减轻脑组织损伤,改善CI症状,修复其神经功能,表明miR-124因子具有较强的脑保护活性,抑制TLR4/NF-κB/CCL2激活是其分子机制之一。本文为CI的发病机制的探明做出了一定贡献,提供了新的治疗靶点,后续会对miR-124调控TLR4/NF-κB/CCL2信号的具体作用机制做更深入全面的研究。