基于UCP2信号研究丙泊酚对脑缺血/再灌注大鼠小胶质细胞极化的影响

肖志博 符少川 谢海 金辉 葛树胜

(海南医学院第一附属医院麻醉科,海南 海口 570102)

心脑手术期间的脑缺血/再灌注(I/R)损伤严重影响了患者的预后,迫切需要更多的防治策略。丙泊酚预处理已在离体与在体实验中被证实对I/R损伤具有明显保护作用〔1〕。然而,这种神经保护作用的分子和亚细胞机制仍不清楚。炎症反应是I/R 损伤的病理特征之一,小胶质细胞是大脑组织中的巨噬细胞,具有在I/R期间介导炎症反应的特性。抑制促炎表型小胶质细胞(M1)极化,促进抗炎表型小胶质细胞(M2)极化,能够有效减少炎症反应,促进神经元新生,重塑神经元回路〔2〕,这可能是I/R损伤中发挥神经保护作用的亚细胞机制。

解耦联蛋白(UCP)2是线粒体内膜蛋白。以往研究显示,UCP2通过调控活性氧(ROS)发挥免疫防御作用〔3〕。丙泊酚很早就被发现可以提高UCP2转录,维持线粒体活性,发挥对I/R保护作用〔4〕。近年研究显示UCP2 缺乏会造成抗氧化作用抑制,促进炎性细胞因子释放,从而增强脑 I/R 损伤〔5〕。然而,丙泊酚发挥抗I/R损伤作用是否与UCP2调控相关,且UCP2对I/R过程中小胶质细胞极化的作用机制尚不清楚。本研究拟探究丙泊酚对I/R大鼠脑组织中UCP2表达和小胶质细胞极化的影响,以期为临床上改善I/R损伤提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 60只清洁级SD雄性大鼠,7周龄,体质量200～230 g,由海南药物研究所有限责任公司提供〔SCXK(琼)2020-0007〕。所有大鼠饲养于海南医学院动物实验中心〔SYXK(琼)2017-0003〕。饲养条件:温度(24±1)℃,湿度(60±5)%,噪音≤80 dB,12 h/12 h循环光照。本实验经海南医学院第一附属医院伦理委员会批准,实验动物操作均遵循3R原则。大鼠入组1 w后,随机分为假手术组,模型组,丙泊酚低剂量组,丙泊酚中剂量组,丙泊酚高剂量组,丙泊酚剂量分别为5、15、25 mg/kg,每组12只。

1.2实验试剂与仪器 丙泊酚(规格:200 mg/20 ml,四川国瑞药业有限责任公司,批号:XLH057),脑卒中线栓(型号:L3200,广州佳灵生物技术公司),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,北京索莱宝生物公司,批号:sc287436),Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司,批号:1002-8743);逆转录试剂盒(美国Thermo公司,批号:1005-2943);荧光定量PCR试剂盒(美国Invitrogen公司,批号:1003-4832);PCR引物(广州锐博生物公司);肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(杭州联科生物公司,批号:849322、489328、493221、109438);离子钙结合接头分子(iba)1抗体(美国abcam公司,批号:ab1843);UCP2抗体、p-核转录因子(NF)-κB抗体、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLRP)3抗体、β-actin抗体(北京博奥森生物公司,批号:bs4273、bs5437、bs3128、bs6373);辣根过氧化物酶(HRP)标记免疫球蛋白(Ig)G二抗(上海碧云天生物公司);酶标仪(Thermo,型号:Fc);倒置显微镜(日本奥林巴斯生物公司,型号:CKX53);PCR检测仪(美国BIO-RAD公司,型号:CFX384);化学发光成像仪(上海天能生物公司,型号:Tanon3500/300R)。

1.3I/R模型构建与实验流程 参考文献中Longa可逆性中动脉线栓法〔6〕构建脑卒中模型。所有大鼠禁食12 h后麻醉,仰卧位固定,沿颈部中线左侧切开约1 cm伤口,暴露出左侧颈动脉与颈内、颈外动脉。将线栓沿颈总动脉插入颈内动脉,前进至中动脉约16 mm。术中中动脉缺血后腹腔注射不同剂量丙泊酚溶液(5、15、25 mg/kg),模型组注射等体积的生理盐水。中动脉缺血2 h后,缓慢拔出线栓,缝合伤口,放回笼中观察。假手术组仅麻醉后分离左颈动脉,不做插线栓操作。24 h后,开展神经功能损伤评分,结束后将大鼠处死,取全脑组织用于TTC染色,免疫组化染色,取海马组织用于炎性细胞因子检测,PCR检测和Western印迹检测。

1.4神经功能损伤评分 参考文献〔7〕中评分标准对所有大鼠开展神经功能评估;0分,正常;1分,轻微的转弯行为,提尾时身体存在卷曲倾向,前肢无法完全伸展;2分,严重的转弯行为,提尾时身体存在卷曲现象;3分,严重的转弯行为,侧推易倒,提尾时保持卷曲姿势维持2 s以上;4分,失去行走或翻正反射;5分,昏迷或垂死;评分越高代表神经功能损伤越严重。

1.5脑梗死体积检测(TTC染色) 取大鼠脑组织,冰箱中冷冻后切成6片,浸没于2% TTC溶液中,37 ℃避光染色30 min,每5 min翻动一次切片。使用ImageJ软件量化统计,计算白色梗死区域体积占大脑体积的比例(%)。

1.6脑脊液中炎性细胞因子检测 通过大鼠枕骨大孔穿刺取脑脊液。将脑脊液1∶9稀释后,在预包被抗IL-1β、抗IL-6、抗TNF-α或IL-10抗体的ELISA板中加入样品,室温反应2 h;根据说明书清洗样品板,加入检测抗体,室温反应1.5 h;清洗样品板,加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素,室温反应30 min;清洗样品板,加入显色底物,避光反应5 min,加入反应终止液,在450 nm处检测最大吸收波长。根据标准曲线计算各个样品炎性细胞因子含量。

1.7大鼠脑皮层组织小胶质细胞活化检测 预冷的生理盐水心脏灌流,取脑组织用4%多聚甲醛固定,经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后切为5 μmol/L冠状切片。将切片置于微波炉中高温烘烤20 min修复抗原,二甲苯脱蜡透化,置入3%甲醇双氧水中孵育30 min,消除内源性过氧化物酶活性,37 ℃孵育1 h,随后滴加iba1抗体,4 ℃湿盒中孵育过夜。次日,取出切片,加入HRP标记的二抗溶液,37 ℃反应2 h。使用二氨基联苯胺(DAB)室温显色15 min,自来水冲洗,梯度乙醇脱水,树胶封片。

1.8荧光定量PCR检测小胶质细胞极化 取大鼠脑组织样本,液氮中粉碎后,根据Trizol试剂盒说明书提取海马组织总RNA,采用紫外吸收法对提取的总RNA样本进行纯度与浓度检测。通过逆转录试剂盒制备cDNA,以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测。条件:95 ℃ 预变性2 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火15 s,60 ℃延伸30 s,40个循环;目的基因mRNA的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。引物序列(5′-3′):GAPDH上游:AACTTTGGCATTGTGGAAGG,下游GGATGCAGGGATGATGTTCT;CD16上游:TTTGGACACCCAGATGTTTCAG,下游GTCTTCCTTGAGCACCTGGATC;TNF-α上游:GCTGAGC TCAAACCCTGGTA,下游CGGACTCCGCAAAGTCT AAG;IL-1β上游:TGTGAAATGCCATTTGA,下游GGTCAAAGGTTTGGAAGCAG;一氧化氮合酶(iNOS)上游:CCCAGAGTTCCAGCTTCTGG,下游CC AAGCCCCTCACCATTATCT;CD206上游:CTTCGGG CCTTTGGAATAAT,下游CTTCGGGCCTTTGGAATAAT;TGF-β上游:TGCGCTTGCAGAGATTAAAA,下游CGTCAAAAGACAGCCACTCA;精氨酸酶(Arg)1上游:ACATTGGCTTGCGAGACGTA,下游ATCACCTTGCCAATCCCCAG;几丁质酶3样分子3(Ym1)上游:TGGAATTGGTGCCCCTACAA,下游GCATAGGGTACTTCCTGGGG。

1.9Western印迹法检测脑皮层组织UCP2蛋白表达 取大鼠脑组织,加入RIPA裂解液匀浆,4 ℃离心12 000 r/min,20 min后取上清液,二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测蛋白浓度后加入上样缓冲液,煮沸10 min使蛋白变性;取上样凝胶,每孔加入20 μg蛋白并开始电泳,电泳结束后半干法将凝胶蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;取PVDF膜以脱脂牛奶封闭,清洗后依次加入一抗抗体,4 ℃过夜,加入二抗稀释液反应1 h;PVDF膜上滴加电化学发光(ECL)液显色后,在化学发光成像仪下获得各个蛋白条带,以β-actin作为内参,通过灰度值计算各个蛋白相对表达量。

1.10统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、Dunnett-t检验。

2 结 果

2.1各组神经功能评分结果 假手术组神经功能没有损伤,评分为0分;与假手术组相比,模型组神经功能评分显著增加(P<0.05);与模型组相比,丙泊酚中、高剂量组神经功能评分明显减少(P<0.05)。见表1。

2.2各组脑梗死体积检测结果 假手术组脑组织TTC染色显示呈深红色,即无梗死区域;与假手术组相比,构建I/R模型大鼠脑组织都出现了不同体积的白色区域;与模型组和丙泊酚低剂量组相比,丙泊酚中、高剂量组脑组织白色区域体积占比显著减少(P<0.05)。见表1、图1。

2.3各组脑脊液中炎性细胞因子检测结果 与假手术组相比,模型组脑脊液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显增加(P<0.05),与模型组和丙泊酚低剂量组相比,丙泊酚中、高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著减少,IL-10含量显著增加;丙泊酚低剂量组TNF-α含量较模型组明显减少(P<0.05)。见表1。

表1 各组神经功能评分、脑梗死体积、炎性细胞因子含量比较

图1 各组脑梗死区域TTC染色

2.4各组脑皮层组织小胶质细胞活化比较 假手术组脑皮层细胞iba1染色密度较低;与假手术组相比,模型组脑皮层iba1染色密度明显增加(P<0.05);与模型组和丙泊酚低剂量组相比,丙泊酚中、高剂量组脑皮层iba1染色密度显著降低(P<0.05)。见图2、表2。

2.5各组脑皮层组织小胶质细胞极化标志物mRNA的比较 与假手术组相比,模型组脑组织M1型小胶质细胞标志物(CD16、TNF-α、IL-1β、iNOS)mRNA表达水平明显增加(P<0.05),而M2型标志物(CD206、TGF-β、Arg1、Ym1)mRNA表达没有明显改变(P>0.05);与模型组和丙泊酚低剂量组相比,丙泊酚中、高剂量组M1型小胶质细胞标志物mRNA明显减少(P<0.05),且M2型标志物mRNA明显增加(P<0.05);丙泊酚低剂量组Ym1显著高于模型组(P<0.05)。见表2、表3。

2.6各组脑组织中UCP2、NF-κB、NLRP3蛋白表达结果 与假手术组相比,模型组脑组织UCP2表达明显减少(P<0.05),而p-NF-κB与NLRP3表达明显增加(P<0.05);与模型组和丙泊酚低剂量组相比,丙泊酚中、高剂量组UCP2表达明显增加(P<0.05),且p-NF-κB与NLRP3表达明显减少(P<0.05)。见表3、图3。

图2 各组脑皮层组织iba1(DAB染色,大图×200,小图×1 000)

表2 各组iba1及CD16、TNF-α、IL-1β、iNOS mRNA含量比较

表3 各组CD206、TGF-β、aRG1、Ym1抗炎细胞因子mRNA含量及UCP2、NF-κB、NLRP3蛋白表达比较

1～5:假手术组、模型组、丙泊酚低剂量组、丙泊酚中剂量组、丙泊酚高剂量组图3 各组UCP2、NF-κB、NLRP3蛋白表达

3 讨 论

I/R损伤是一种复杂的生理病理过程,神经炎症、氧化应激、线粒体功能障碍等共同导致了缺血区神经元死亡,造成局部梗死。本研究显示无论是否经历丙泊酚治疗,I/R模型大鼠脑组织都出现了局部梗死区域。与临床CT诊疗中脑实质密度降低,呈片状或斑片状低密度影现象匹配〔8〕。脑组织作为机体活动的高级指挥中心,局部梗死必然会造成行为活动障碍,出现各种神经功能损伤。本研究中,神经功能评分显示模型组大鼠右前肢无法完全伸展,仅能向一侧转圈,且侧推易跌倒,甚至有半侧瘫痪的现象。这些症状对应了临床脑卒中患者预后常见的机体平衡能力弱,肢体行为迟缓甚至瘫痪的情况〔9〕。与此同时,以上结果与文献中大鼠I/R模型症状一致〔10〕,因此本研究I/R损伤模型构建成功。

有研究〔11〕提示,炎症反应是I/R损伤不可忽视的诱导途径。丙泊酚是一种应用广泛的短效静脉麻醉药,已有研究〔12〕证实,丙泊酚能够调控炎症反应,发挥保护作用,但该保护剂量基于不同模型,不同个体仍存在差异。Lv等〔13〕研究显示,15 mg/kg丙泊酚即可降低miR-494 表达从而抑制肝缺血再灌注损伤,预防心肌细胞凋亡和改善心功能。在肺缺血再灌注损伤中,Zhang等〔14〕研究使用了18 mg/kg丙泊酚治疗,结果显示过量的自噬反应与炎症因子释放受到抑制。然而,对于脑损伤模型,可能由于血脑屏障存在的原因,多数研究中干预剂量都超过了20 mg/kg。Dai等〔15〕研究显示,对于睡眠剥夺造成的大鼠学习与记忆能力损伤,30 mg/kg丙泊酚才能发挥抑制炎症反应的作用。此外,Tao等〔16〕研究也有显示,30 mg/kg丙泊酚对脑 I/R 损伤产生明显保护作用,其机制可能与抑制凋亡诱导因子的核易位相关。综合以上研究显示,丙泊酚对外周缺血再灌注保护作用剂量可能为10～20 mg/kg,对脑缺血再灌注保护作用剂量可能为20～30 mg/kg。因此,本研究分别采用了5、15、25 mg/kg剂量进行了实验研究。最终结果证实,丙泊酚剂量15 mg/kg与25 mg/kg才能减少脑梗死体积,提高神经功能,抑制炎症反应,发挥抗I/R保护作用。

过度的炎症反应是NF-κB/NLRP3信号诱导小胶质细胞活化结果〔17〕。小胶质细胞是中枢神经系统中与外周系统巨噬细胞功能相似的先天性免疫细胞,通常被认为是大脑的第一道防线。I/R损伤早期,为了清除外周侵袭的病原微生物与神经毒性物质,小胶质细胞活化后发挥吞噬作用〔18〕。此时,小胶质细胞主要极化为保护性抗炎M2表型。抗炎表型可以诱发包括神经发生、轴突重塑和髓鞘再生在内的多种机制修复受损组织〔19〕。不同的抗脑缺血药物治疗过程中都有发现抗炎性M2表型小胶质细胞的比例增加〔20〕。

随着I/R损伤进展,小胶质细胞会动态地改变其表型和功能,逐渐转变促炎性M1表型。促炎性小胶质细胞表型极化增加会加剧脑损伤,阻碍神经元新生,干扰脑卒中后神经功能修复〔21〕。本研究显示,脑缺血组小胶质细胞活化,多表现为促炎性M1表型。丙泊酚干预下iba1表达明显减少,小胶质细胞促炎性M1表型标志物降低,促炎性细胞因子释放减少,且抗炎性M2表型增加。与此同时,IL-10作为一种抗炎因子,在丙泊酚诱导下释放增加。以上结果提示,丙泊酚具有抑制I/R过程中小胶质细胞活化,提高小胶质细胞向M2表型极化的能力。

本研究进一步发现,小胶质细胞向促炎表型的极化会伴随着UCP2表达降低。研究报道UCP2可以调节线粒体呼吸链能量和活性氧的产生,直接影响NF-κB磷酸化〔22〕。此外,UCP2-/-小鼠在脂多糖(LPS)刺激下会产生大量的氧化因子与促炎因子,且在此条件下NF-κB系统被激活〔23〕。NF-κB是由两个DNA 结合亚基组成,在细胞质中与NF-κB抑制蛋白(IκB)结合,以无活性形式存在。部分刺激信号如活性氧、细胞色素C会导致IκB磷酸化,使IκB被泛素修饰与降解,从而使NF-κB二聚体移位至细胞核以调节靶基因表达〔24〕。NLRP3是NF-κB下游信号蛋白,在p-NF-κB的刺激下,募集凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和胱天蛋白酶-1前体(pro-caspase-1),导致caspase-1激活和细胞因子释放,包括IL-1β和IL-18等。NLRP3炎症小体激活会触发小胶质细胞活化,诱导M1型的极化,并会加剧神经炎症,提高脑缺血损伤〔25〕。因此,本结果中UCP2在模型组中表达降低会介导氧化因子等刺激因子含量升高,造成NF-κB磷酸化水平增加,导致下游NLRP3活化,导致小胶质细胞的活化,并诱导小胶质细胞向炎性表型的极化。然而,丙泊酚通过上调UCP2,调节了线粒体呼吸链电子传递,减少了活性氧的产生,从而抑制NF-κB的磷酸化,最终调节了小胶质细胞的活化与极化。

本研究采用中动脉栓塞构建I/R模型,模拟了临床上急性脑卒中引起的不同程度脑组织缺血损伤,更接近临床患者的病理生理,能够用于临床脑缺血损伤规律及药物疗效的等效评估。此外,本研究结果显示,中/高剂量(15～25 mg/kg)丙泊酚可通过上调UCP2表达,抑制NF-κB的磷酸化,减少小胶质细胞的激活并调控小胶质细胞由M1型向M2型极化,降低炎性细胞因子的释放,进而改善I/R大鼠神经功能损伤。通过等效剂量换算可以得出临床上2.5～4.2 mg/kg丙泊酚能够为缺血性脑卒中患者提供较好的保护作用。然而,本研究仅对I/R过程中丙泊酚干预下UCP2蛋白表达进行了检测,未采用UCP2抑制剂或基因敲除动物模型开展研究,且对UCP2调控的氧化因子释放,抗氧化因子的合成探究较少。