LncRNA CASC9靶向调节miR-195-5p/VEGFA轴对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

黄文博 杜申钊 曾静 谷耀东

(南阳市中心医院口腔科,河南 南阳 473000)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是常见的头颈部恶性肿瘤,占口腔恶性肿瘤的90%,由于其恶性程度高,易发生转移,患者5年生存率不高,因此从分子水平研究OSCC发生发展机制,对其靶向治疗具有重要意义〔1,2〕。长链非编码RNA癌易感性候选基因(LncRNA CASC)9属于LncRNA,研究显示,LncRNA CASC9在OSCC组织与细胞系中上调表达,与OSCC临床分期、肿瘤大小、颈淋巴结转移有关,抑制LncRNA CASC9表达,可显著抑制OSCC细胞增殖、迁移与侵袭〔3〕。报道显示,LncRNAs可通过竞争性结合microRNA(miRNA)反应元件来靶向miRNA以抑制miRNA功能,如抑制LncRNA CASC9表达可通过调节miR-195-5p/丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)4轴加重败血症诱导的急性肺损伤〔4〕。有研究显示,miR-195在OSCC中发挥抑癌基因的作用,过表达miR-195可抑制OSCC细胞增殖与侵袭〔5〕。另有研究显示, miR-195-5p能通过靶向血管内皮生长因子(VEGF)A抑制宫颈癌细胞侵袭和转移,并能促进肿瘤移植模型小鼠存活〔6〕。LncRNA CASC9是否通过调控miR-195-5p/VEGFA轴影响OSCC细胞增殖、凋亡和迁移尚未见报道,本研究将探索LncRNA CASC9对OSCC细胞增殖、凋亡、迁移的影响,并初步探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 人OSCC细胞系SCC15、CAL27、SCC-4和Tca83及人正常口腔黏膜角化细胞(hNOK)购自美国ATCC细胞库;抑制LncRNA CASC9表达质粒(si-CASC9)及阴性对照(si-NC)、miR-195-5p模拟物(miR-195-5p mimics)及阴性对照(miR-NC)、miR-195-5p抑制剂(miR-195-5p inhibitor)及阴性对照(NC inhibitor)、VEGFA过表达质粒(VEGFA)及对照(pc-DNA)、miR-195-5p、LncRNA CASC9及U6、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物购自广州锐博生物技术有限公司;Lipofectamine3000转染试剂(L3000-015)、海肾-萤火虫荧光素酶双检测试剂盒(16186)购自Thermo Scientific;TriQuick Reagent(总RNA提取试剂,R1100)、膜联蛋白Ⅴ异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒(CA1020)、CCK-8试剂盒(CA1210)购自北京索莱宝;逆转录试剂盒(D7168M)及SYBR Green qPCR Mix(D7260)购自Beyotime公司;兔抗人VEGFA(65373)、增殖细胞核抗原(PCNA,13110)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3(14220)、基质金属蛋白酶(MMP)-9(13667)抗体购自美国CST公司。

1.2组织与细胞标本 选择2018年4月至2021年6月在南阳市中心医院进行手术治疗的OSCC患者51例,手术过程中取OSCC组织及癌旁组织,患者术前未经任何放、化疗等抗肿瘤治疗,术后经病理诊断为OSCC。SCC15、CAL27、SCC-4、Tca83及hNOK细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测OSCC组织与癌旁组织及细胞中LncRNA CASC9表达。本研究经医院伦理委员会批准。

1.3细胞转染及分组 SCC15细胞以2×105个/孔接种到6孔板中,待细胞贴壁生长时,使用Lipofectamine3000转染试剂对细胞进行转染,将SCC15细胞分为空白对照(Control)组、si-NC组、si-CASC9组、miR-NC组、miR-195-5p mimics组、si-CASC9+miR-195-5p inhibitor组、si-CASC9+NC inhibitor组、miR-195-5p mimics+pc-DNA组、miR-195-5p mimics+VEGFA组,每组设置6个复孔,转染48 h后检验转染效率。

1.4qRT-PCR检测LncRNA CASC9、miR-195-5p表达 使用总RNA提取试剂提取总RNA,逆转录试剂盒合成cDNA后,qRT-PCR检测 LncRNA CASC9、miR-195-5p表达。引物序列(5′-3′):LncRNA CASC9上游引物:AGATGAAGCCGGTACCTCAGAT,下游:TCACTTTAAAGAGGGAGAGGAG;GAPDH上游引物:TATGATGATATCAAGAGGGTAGT,下游:TG TATCCAAACTCATTGTCATAC;miR-195-5p上游引物:GGCGTCGTATCCAGTGCAAT,下游:GTCGTATCCAGTGCGTGTCG;U6上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA,下游:AACGCTTCACGAATTTGCGT。反应结束后,分别以GAPDH、U6为内参,采用2-ΔΔCt方法计算LncRNA CASC9、miR-195-5p相对表达量。

1.5miR-195-5p与 LncRNA CASC9、VEGFA的靶向关系验证 通过生物信息学(StarBase、targetscan数据库)分析显示 LncRNA CASC9、VEGFA与miR-195-5p有靶向结合位点,分别构建LncRNA CASC9、VEGFA的野生型质粒和突变型质粒,并分别与miR-NC、miR-195-5p mimics共转染SCC15细胞,双荧光素酶系统检测相对荧光素酶活性。

1.6CCK-8法检测细胞增殖 转染后的SCC15细胞制备成2×106个/ml的单细胞悬液,以每孔100 μl接种至96孔板中,于培养箱中培养24、48、72 h时每孔加入10 μl CCK-8溶液,孵育2 h,酶标仪测定波长450 nm处吸光度(OD)值。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 SCC15细胞转染48 h后,使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡,流式细胞仪计算细胞凋亡率。

1.8Transwell实验检测细胞迁移 转染后的SCC15细胞使用无血清培养液稀释,取200 μl培养液加至Transwell上室,下室加入含10%胎牛血清的培养基,培养24 h后,取出Transwell板,10%甲醛固定10 min,0.1%Giemsa染色5 min,显微镜观察,随机观察5个视野,计算每个视野平均迁移细胞数目。

1.9Western印迹法检测VEGFA、PCNA、Caspase-3、MMP-9蛋白表达 离心收集各组转染后的SCC15细胞,加入RIPA裂解液离心提取总蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度,取20 μg蛋白变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转膜,5%脱脂奶粉封闭2 h,分别加入VEGFA、PCNA、Caspase-3、MMP-9一抗稀释液(按照说明书进行稀释),室温孵育2 h,加入二抗孵育1 h,电化学发光(ECL)试剂显色,以β-actin为内参,ImageJ5.0软件分析灰度值。

1.10统计学方法 采用SPSS25.0软件进行t检验、单因素方差分析及SNK-q检验;采用GraphPad Prism8.0绘制生长曲线与作图。

2 结 果

2.1LncRNA CASC9在OSCC组织及细胞中上调表达 qRT-PCR结果显示,LncRNA CASC9在OSCC组织与细胞中(2.47±0.25)较癌旁组织(1.02±0.15)表达显著上调(P<0.05)。与hNOK细胞(1.02±0.15)比较,SCC15细胞(3.24±0.50)、CAL27细胞(2.13±0.43)、SCC-4细胞(2.85±0.38)及Tca83细胞(1.97±0.31)LncRNA CASC9表达水平显著升高(P<0.05),且SCC15细胞中LncRNA CASC9表达水平最高,故选择SCC15细胞系进行后续实验。

2.2抑制LncRNA CASC9表达对SCC15细胞增殖、凋亡及迁移的影响 SCC15细胞中抑制LncRNA CASC9表达后,与si-NC组比较,CCK-8实验结果显示,SCC15细胞增殖活性(24、48、72 h)明显降低(P<0.05);Transwell实验结果显示,SCC15细胞迁移数目显著降低(P<0.05);流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,细胞凋亡率显著升高(P<0.05);Western印迹结果显示,PCNA、MMP-9蛋白表达水平显著降低,Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05),见图1、图2、表1、表2、图3。

图1 抑制LncRNA CASC9表达对SCC15细胞凋亡的影响

图2 Transwell检测各组SCC15细胞迁移(结晶紫染色,×200)

表1 抑制LncRNA CASC9表达对SCC15细胞凋亡及迁移的影响

表2 抑制LncRNA CASC9表达对SCC15细胞增殖的 影响

图3 各组SCC15细胞PCNA、Caspase-3、MMP-9蛋白表达

2.3LncRNA CASC9靶向调控miR-195-5p 如图4所示,经生物信息学分析发现LncRNA CASC9与miR-195-5p有结合位点,CASC9-wt、CASC9-mut分别与miR-NC、miR-195-5p mimics共转染SCC15细胞后,双荧光素酶检测结果显示,与miR-NC比较,CASC9-wt与miR-195-5p mimics共转染SCC15细胞相对荧光素酶活性显著降低(P<0.05),见表3;抑制LncRNA CASC9表达后,Control组、si-NC组及si-CASC9组miR-195-5p表达分别为1.05±0.12、1.01±0.13和1.87±0.21,si-CASC9组显著高于si-NC组(P<0.05),抑制LncRNA CASC9表达可显著提高miR-195-5p表达水平。

图4 LncRNA CASC9与miR-195-5p靶向预测

表3 相对荧光素酶活性检测结果

2.4过表达miR-195-5p对SCC15细胞增殖、凋亡及迁移的影响 SCC15细胞中过表达miR-195-5p后,与miR-NC组比较,CCK-8实验结果显示,SCC15细胞增殖活性(48、72 h)明显降低(P<0.05);Transwell实验结果显示,SCC15细胞迁移数目显著降低(P<0.05);流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,细胞凋亡率显著升高(P<0.05);Western印迹结果显示,PCNA、MMP-9蛋白表达水平显著降低,Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05),见图5、图6、表4、表5、图7。

图5 过表达miR-195-5p对SCC15细胞凋亡的影响

表4 过表达miR-195-5p对SCC15细胞增殖的影响

表5 过表达miR-195-5p对SCC15细胞凋亡及迁移的影响

图7 各组SCC15细胞PCNA、Caspase-3、MMP-9蛋白表达

2.5抑制miR-195-5p表达逆转抑制LncRNA CASC9表达对SCC15细胞增殖、凋亡及迁移的作用 SCC15同时细胞转染si-CASC9与miR-195-5p inhibitor后,与si-CASC9+NC inhibitor组比较,CCK-8实验结果显示,si-CASC9+miR-195-5p inhibitor组SCC15细胞增殖活性(24、48、72 h)明显升高(P<0.05);Transwell实验结果显示,SCC15细胞迁移数目显著增加(P<0.05);流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,细胞凋亡率显著降低(P<0.05);Western印迹结果显示,PCNA、MMP-9蛋白表达水平显著升高,Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05),见图8、图9、表6、表7、图10。

图8 流式细胞仪检测各组SCC15细胞凋亡

图9 Transwell检测各组SCC15细胞迁移(结晶紫染色,×200)

表6 同时抑制miR-195-5p与LncRNA CASC9表达对SCC15细胞增殖的影响

表7 同时抑制miR-195-5p与LncRNA CASC9表达对SCC15细胞凋亡及迁移的作用

1～3:si-CASC9组、si-CASC9+NC inhibitor组、si-CASC9+miR-195-5p inhibitor组图10 各组SCC15细胞PCNA、Caspase-3、MMP-9蛋白表达

2.6miR-195-5p与VEGFA的靶向关系验证 如图11所示,miR-195-5p与VEGFA基因有靶向结合位点,VEGFA-wt、VEGFA-mut分别与miR-NC、miR-195-5p mimics共转染SCC15细胞,双荧光素酶实验结果显示,与miR-NC比较,VEGFA-wt与miR-195-5p mimics共转染SCC15细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05),且过表达miR-195-5p后,Control组、miR-NC组及miR-195-5p mimics组VEGFA表达分别为1.01±0.11、1.03±0.10和0.25±0.04,miR-195-5p mimics组显著低于miR-NC组(P<0.05),过表达miR-195-5p可显著抑制VEGFA蛋白表达水平,见表8、图12。

图11 miR-195-5p与VEGFA的靶向预测

表8 相对荧光素酶活性检测结果

图12 Western印迹检测各组VEGFA蛋白表达

2.7上调VEGFA表达逆转过表达miR-195-5p对SCC15细胞增殖、凋亡及迁移的作用 SCC15细胞同时转染miR-195-5p mimics与VEGFA质粒后,与miR-195-5p mimics+pc-DNA组比较,CCK-8实验结果显示,miR-195-5p mimics+VEGFA组SCC15细胞增殖活性(48、72 h)明显升高(P<0.05);Transwell实验结果显示,SCC15细胞迁移数目显著增加(P<0.05);流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,细胞凋亡率显著降低(P<0.05);Western印迹结果显示,PCNA、MMP-9蛋白表达水平显著升高,Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05),见表9、图13、图14、表10、图15。

表9 同时过表达VEGFA和miR-195-5p对SCC15细胞增殖的影响

图14 Transwell检测各组SCC15细胞迁移(结晶紫染色,×200)

表10 同时过表达VEGFA和miR-195-5p对SCC15细胞凋亡及迁移的影响

1～3:miR-195-5p mimics组、miR-195-5p mimics+pc-DNA组、miR-195-5p mimics+VEGFA组图15 各组细胞VEGFA、PCNA、MMP-9蛋白表达

3 讨 论

LncRNA可通过参与调节细胞增殖、细胞周期及分化等过程参与多种病理生理过程,多项报道显示,CASC11、结肠癌相关转录本(CCAT)1、磷酸酶和张力同源物假基因(PTENP)1等多种LncRNA异常表达与OSCC有关,可参与调控OSCC细胞的增殖、迁移与侵袭,与OSCC的恶性进展、转移和预后密切相关〔7～9〕。LncRNA CASC9在食管癌、鼻咽癌和肝细胞癌等多种肿瘤中表达上调,发挥癌基因的作用〔10,11〕。LncRNA CASC9可通过调节miR-423-5p/性别决定区域Y-BOX(SOX)12轴调控舌鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔12〕。Yang等〔13〕研究显示,LncRNA CASC9在OSCC组织与细胞中高表达,且LncRNA CASC9高表达与患者的肿瘤大小、临床分期、局部淋巴结转移及总生存时间有关,在OSCC细胞中敲除LncRNA CASC9表达可显著抑制细胞增殖,促进细胞自噬和凋亡,但其具体作用机制有待进一步研究。本研究qRT-PCR检测结果显示,LncRNA CASC9在OSCC组织与细胞表达显著上调,且在SCC15细胞中LncRNA CASC9表达水平最高,故选择SCC15细胞系进行后续实验。本研究结果提示,抑制LncRNA CASC9表达可显著抑制SCC15细胞增殖及迁移,并促进细胞凋亡,与Yang等〔13〕报道结果类似。

LncRNA可通过ceRNA竞争性抑制miRNA而影响肿瘤的发展,如Zhang等〔14〕研究表明,LncRNA CASC9抑制miR-758-3p上调转化生长因子(TGF)-β2促进膀胱癌细胞增殖和上皮间质转化。本研究通过生物信息学分析发现, LncRNA CASC9与miR-195-5p存在靶向结合位点,且双荧光素酶报告基因实验结果显示,LncRNA CASC9与miR-195-5p存在靶向关系。miR-195-5p为miRNA一种,OSCC中miR-195-5p呈低表达,过表达miR-195-5p可通过靶向抑制三重基序蛋白(TRIM)14抑制OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭〔15〕。miR-195-5p在其他肿瘤,如宫颈癌、肝癌中亦低表达,发挥抑癌作用〔16,17〕。本研究提示,LncRNA CASC9靶向miR-195-5p调控OSCC细胞增殖、凋亡与迁移。

研究显示, miR-195-5p还可通过靶向抑制VEGFA表达来抑制骨肉瘤细胞迁移与侵袭〔18〕。VEGFA是促血管生长因子家族成员,可参与肿瘤血管生成,miR-195-5p/VEGFA在肿瘤的进展中发挥重要调控作用〔19〕。本研究结果表明,抑制LncRNA CASC9表达可通过靶向调节miR-195-5p/VEGFA 轴,抑制SCC15细胞增殖及迁移,促进细胞凋亡。