骨髓CD11b+巨噬细胞分泌VEGF-A165b抑制老年小鼠新血管形成的作用机制

张文晨 刘元值 孙文静 成宪武 赵光贤

(延边大学附属医院心内科,吉林 延吉 133000)

研究表明,年龄与血管老化、血管再生减弱、骨髓(BM)中内皮祖细胞减少、血管内皮细胞凋亡和增殖之间的不平衡,细胞外微环境的变化(如生长因子、炎性细胞因子、氧化应激等)有关〔1～5〕。血管内皮生长因子(VEGF)-A是关键的促血管生成因子之一,在大多数生理和病理衰老条件下其表达水平会降低〔6～10〕。在人体中, VEGF-A基因的mRNA被剪接形成不同的异构体mRNA〔5,10～14〕。研究表明,抗VEGF-A165b、失活Wnt5a/strp5调节系统可以解决代谢紊乱所致的小鼠血管再生能力下降问题〔15〕。目前人们已经做了许多尝试,以激活血管再生能力,防止细胞死亡或促进细胞增殖〔3,4,16～18〕。尽管这些尝试已经取得了进展,但目前其在临床上的运用仍很局限〔19,20〕。而且,在老年动物(如小鼠)和人类中,对于慢性缺血条件下血管生成减少的分子和细胞机制仍是未知的。通过本研究可以进一步揭示衰老及缺血对血管生成能力影响的细胞机制。本研究探讨BM源性CD11b+巨噬细胞分泌的VEGF-A165b在老年小鼠缺血组织中抗新血管形成的作用机制。

1 材料和方法

1.1动物 所有动物使用程序经名古屋大学医学研究生院动物护理和使用委员会批准。选用8周龄和>72周龄的C57BL/6J雄性小鼠(Chukaukagakushizai,日本),均提供标准饮食和自来水。

1.2材料 小鼠抗CD45单克隆抗体(35-Z6,sc-1178),兔抗Flt-1多克隆抗体(C-17,sc-316),抗血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体(C-1,sc-7269),Toll样受体2多克隆抗体(TLR2sc-10739)和山羊3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体(sc-20357)购自Santa Cruz Biotechnology(圣克罗伊)。VEGFR2 多克隆抗体(ab38473)、Galectin-3 单克隆抗体(ab76245)和Wnt5a多克隆抗体(ab72583)购自Abcam(英国)。 兔抗Flk-1多克隆抗体(#2472)、Mac-3(M3/84)单克隆抗体购自Cell signaling Technology(丹弗斯公司)。鼠抗鼠Mac-3(M3/84)单克隆抗体、SC35单克隆抗体(aSC35)、FITC结合鼠抗鼠CD31(MEC13.3) 单克隆抗体和R-PE结合鼠抗鼠c-Kit(CD117,2B8) 单克隆抗体购自BD Pharmingen(加利福尼亚州圣地亚哥)。VEGF酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自R&D Systems(德国慕尼黑)。内皮基础培养基(EBM)-2和内皮生长培养基(EGM)-2购自Lonza(马里兰州沃克斯维尔)。RPMI1640购自Life technologies Corporation(美国纽约),人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自Applications(加州圣地亚哥)。β-Gal染色和cOmplete Mini蛋白酶抑制剂混合物购自Roche Diagnostics GmbH(德国曼海姆)。 RNeasy Micro Kit和SYBRTMGreen Master Mix购自于GIAGEN(德国希尔登),硝酸纤维素转移膜购自Amersham Bioscience(新泽西州皮斯卡塔韦),生长因子降低胶基质购自BD Bioscience(马里兰州贝德福德),Diff-Quik染色液购自International Regents Corporation(日本东京)。Cell Titer 96AO检测试剂盒购自Promega(麦迪逊市), CD11b和CD117微珠试剂盒及MACS分离柱购自Miltenyli Biotec(德国)。

1.3后肢缺血模型建立和血流分析 制备8周龄小鼠(对照组)和>72周龄小鼠(观察组)后肢缺血模型戊巴比妥钠麻醉(腹膜内50 mg/kg)后,对两组行左后肢左静脉和股动脉切除术〔7〕。使用血流成像仪(LSBFI,OMEGAZONE,OZ-1,OmEGA WAVE,Inc.,东京,日本)评估血流恢复情况。在术前和术后第0、4、7、14天评估左、右腿和脚的血流情况。使用不同颜色表示每条腿的血流量。腿部血流的定量分析表示为缺血性与非缺血性血流灌注比值,以消除由于环境温度和光照而导致的数据变化〔21〕。

1.4免疫组织化学分析 在术后第4天,对两组缺血和非缺血后肢肌肉组织进行免疫组化分析,使用针对巨噬细胞的抗体Mac-3(1∶50)染色。 在每只小鼠的4个切片中随机选取5个显微镜视野,计算巨噬细胞数量,并表示为每高倍视野(×200)Mac-3细胞数量。在每只小鼠的内收肌4个不同横截面随机选取4个显微镜视野,计算毛细血管和肌纤维数量,并表示为每根肌纤维的毛细血管数(×200)〔22〕。

1.5基因表达测定 从裂解物(CD11b+巨噬细胞及c-Kit+细胞)及肌肉组织中分离总RNA,并使用RNeasy Micro Kits进行反转录。将cDNA用于实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析〔4〕。将每个目标RNA水平标准化为各自的GAPDH mRNA水平。每个样品重复3次。

1.6Western印迹 将30 min内从肌肉样本中提取的蛋白质与低温裂解缓冲液〔150 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)、pH 7.4、0.25%十二烷基硫酸钠(SDS),1%Triton X-100〕混匀。补充蛋白酶抑制剂混合物(1片/10 ml),1 mmol/L苯甲基磺酰氟和1 mmol/L原钒酸钠。在还原条件下,将40 μg蛋白质样品,上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,然后转移至硝酸纤维素转移膜上,用靶向的第一抗和相关的第二抗进行检测。使用ImageJ软件对条带进行密度分析。

1.7免疫荧光 将BM源生的c-Kit阳性细胞(2×43个细胞/ml)黏附到具有变性胶原的盖玻片上,将细胞在含4%胎牛血清(FBS)的EGM-2中培养24 h。用4%的甲酰甲醛固定后,用含1%甘油的磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,每次3次。用0.1%牛血清白蛋白(BSA)/PBS封闭细胞,然后使用免疫荧光进行确定〔22〕。

1.8ELISA 用市售试剂盒测定血浆和细胞条件培养基中的VEGF-A水平〔4〕。

1.9BM衍生的内皮祖细胞(EPC)和巨噬细胞的分离和培养 从对照组和观察组中收集BM来源细胞,分别使用MACS分离柱与CD117磁珠或CD11b磁珠分离c-Kit+EPC样细胞和CD11b+巨噬细胞〔23,24〕。

1.10细胞培养 在95%的空气和5%的CO2的潮湿环境中,添加4%FBS和EGM-2培养5～8代(年轻)和18～20代(老年)的HUVECs细胞〔4〕。β-半乳糖苷酶染色评估HUVECs衰老表型。

1.11微管生成测定 将HUVECs在24孔板中以2×104细胞/孔的浓度在含有20 ng/ml VEGF-A的EBM-2的凝胶基质上培养24 h,以诱导微管形成。对于特殊实验,将HUVECs在24孔板中以每孔2×104个细胞的浓度,分别在含有VEGF-A(VEGF-A组)、对照组年轻小鼠(Y)组织中CD11b+细胞(YCD11b+CM组)、观察组年老小鼠(A)组织中CD11b+细胞(ACD11b+CM组)、VEGF-A+YCD11b+CM(VEGF-A+YCD11b+CM组)、VEGF-A+ACD11b+CM(VEGF-A+ACD11b+CM组)或YCD11b+CM+ACD11b+CM(YCD11b+CM+ACD11b+CM组)的EBM-2(两种培养基中VEGF-A为20 ng/ml,两种培养基均为90 μg/ml)中培养24 h,然后进行长度计算。使用BZ-Ⅱ analuzer,Exe1.42软件对小管发生进行量化,以计算每板口的6个区域中的芽的数量和长度〔22〕。两名观察者以盲法评估毛细血管密度及内皮芽的长度和数量。

1.12细胞迁移、侵袭和增殖测定 在Transwell的24孔原始织培养板上进行细胞迁移和侵袭〔7〕。使用Diff-Quik染色溶液对迁移并侵入膜外侧的细胞进行染色,并在高倍镜(×200)下对每个样本选定的5～7个视野中进行计算。使用非放射性细胞增殖检测试剂盒(Cell Titer 96AO Assay)试剂盒进行细胞增殖测定〔22〕。在存在或不存在VEGF-A的情况下,将细胞接种在明胶包被的96孔板上,在100 μl EBM-2/0.3% BSA中以5 ×103个细胞接种,或在指定浓度的4种细胞培养基中接种48 h〔Yc-Kit+CM或YCD11b+CM和Ac-Kit+CM或ACD11b+CM在无血清EBM-2(前者)或RPMI1640培养基(后者)中缺氧培养36 h(c-Kit+细胞)或48 h(CD11b+细胞)。收集培养基,用100 K和10 K AmiconUltra Contractors分离含有约20 kD蛋白质的特殊原始分,并将其蛋白质浓度调节至1.5 mg/ml用于细胞实验〕。直接向培养基中加入20 μl吩嗪异氟甲酸酯和四唑紫化合物的混合物,孵育1～2 h,然后在492 nm处测定吸光度。将各原始样本一式三份测吸光度,并取其平均值。为了探究VEGF-A165b的来源,将两组BM源性CD11b+细胞或c-Kit+细胞接种于EBM-2中,在正常氧含量或缺氧条件下(6孔板放入缺氧室)培养36 h,然后进行实时定量聚合酶链式反应检测BM源性CD11b+细胞和c-Kit+细胞中VEGF-A165b mRNA的表达水平。将5×103HUVECs分别在添加加热或未加热的Yc-Kit+CM、Ac-Kit+CM、YCD11b+CM或ACD11b+CM(每个20 μl/100 μl EBM-2)的EBM-2中培养48 h,然后进行细胞增殖检测(MTS实验)。

1.13统计学分析 采用SPSS26.0统计软件进行单因素方差分析,Scheffe多重比较事后检验;采用双向重复测量方差分析和Bonferroni事后检验进行血流数据统计分析;计量资料两组间采用t检验。

2 结 果

2.1衰老在缺血时损害血管生成 LSBFI分析显示,对照组术后第14天与第4天缺血/非缺血血流比率有统计学差异(P<0.05),表明血流恢复。而观察组术后第4天与第14天相比无统计学差异(P>0.05),表明血流未恢复。与对照组相比,观察组缺血/非缺血血流比率的恢复持续受到损害。术后第14天定量免疫染色显示,观察组非缺血肌肉和缺血肌肉中毛细血管密度〔(1.01±0.14)、0.61±0.10)个/mm2〕明显低于对照组〔(1.34±0.20)、(1.47±0.10)个/mm2;t=3.272、14.943,P=0.009、<0.001〕,表明衰老损害了血管再生能力。见表1、图1、图2。

2.2衰老对VAGF-A165b 及下游信号传导通路蛋白的影响 与对照组相比,观察组缺血肌肉组织中VEGF-A、Galetin-3及TLPR2蛋白水平显著增加,磷酸化VEGF受体(p-VEGFR)2和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)水平明显降低(P<0.05)。观察组缺血肌肉中VAGF-A165b mRNA明显高于对照组。见图3、表2、表3。提示VAGF-A165b过度表达可能是导致VEGFR2/Akt失活的原因,这对于老年动物缺血诱导的血运重建能力下降至关重要。

2.3衰老对Wnt5a/11和SC35表达的影响 与对照组相比,观察组缺血肌肉中Wnt5a、SC35蛋白表达明显增高(P<0.05)。观察组缺血肌肉中Wnt5a、Wnt11 mRNA水平明显增加(P<0.05)。见表3。表明在老龄动物中,非典型Wnt5a/11-SC35轴的改变可能诱导了VAGF-A165b过度表达。

表1 两组术后不同时间点缺血/非缺血血流比率

图1 两组血流恢复状态

图2 两组股内收肌组织毛细血管密度(免疫组化染色,×200)

图3 两组术后第4天靶蛋白水平比较

表2 非缺血组织及缺血组织中VEGF-A、p-VEGFR2、p-Akt、SC35、Wnt5a、Galectin-3和TLPR2蛋白表达水平

表3 非缺血组织及缺血组织中VEGF-A165b、Wnt家族和VEGF-A164a mRNA表达

2.4骨髓来源的巨噬细胞通过诱导VAGF-A165b对老龄小鼠缺氧反应表现出抗血管生成作用 如表4所示,未加热的对照组c-Kit+细胞(Yc-Kit+CM)和观察组c-Kit+细胞(Ac-Kit+CM)具有相似的刺激效果。与未加热的ACD11b+CM培养基相比,未加热的YCD11b+CM培养基明显刺激HUVECs增殖(P<0.05)。将HUVECs接种在添加了VEGF-A、YCD11b+CM+VEGF-A、ACD11b+CM+VEGF-A的培养基中测定吸光度(OD)值,结果显示添加了YCD11b+CM+VEGF-A培养基的OD值(291.67±12.58)与只添加VEGF-A(252.33±7.51)相比,YCD11b+CM增强VEGF-A诱导的细胞增殖(P<0.05)。见图4。YCD11b+CM+VEGF-A与ACD11b+CM+VEGF-A培养基相比,ACD11b+CM培养基明显抑制了这种作用(P<0.05)。将HUVECs接种在两种条件培养基,分别向CD11b+条件培养基及c-Kit+条件培养基中添加YCD11b+CM后测定小管生成长度,结果显示添加YCD11b+CM的两种条件培养基中CD11b+条件培养基HUVECs小管生成长度〔(6 220.67±241.00)μm〕较c-Kit+条件培养基(1 783.33±152.73)μm〕明显更长(P<0.01)。如表5所示,相比对照组,观察组BM源性CD11b+巨噬细胞在缺氧应激条件下VEGF-A165b mRNA水平明显增加(P<0.05)。然而,缺氧应激对VEGF-A165b mRNA的影响既不是Yc-Kit+CM,也不是Ac-Kit+CM。综上,BM源性CD11b+巨噬细胞可能是老年小鼠VAGF-A165b表达的一个重要来源。

表4 两组HUVECs增殖(OD值)试验

图4 各组HUVECs小管生成实验(×200)

表5 两组CD11b+细胞和c-Kit+细胞中VEGF-A165b mRNA的表达水平

2.5衰老损害祖细胞的内在功能 术前,观察组血浆sFlt1水平较对照组明显降低(P<0.05);术后第4、7、14天,相比对照组,观察组血浆sFlt1水平明显增高(P<0.05),表明衰老可产生抗血管生成状态。相比对照组,观察组缺血肌肉浸润的巨噬细胞和白细胞数量显著增加。观察组缺血组织中CD45+、Mac3+细胞数量明显增多(P<0.05)。观察组缺血组织中巨噬细胞衍生的基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2凝胶溶解活性水平明显升高(P<0.05)。相比对照组,观察组外周血中c-Kit+/CD31+细胞祖细胞的数量明显减少(P<0.05)。血管重建受损可能与骨髓源性巨噬细胞固有功能下降密切相关。细胞表达c-Kit+和CD31+EPC表面标志物。结果表明老化显著损害VEGF-A诱导的c-Kit+迁移和侵袭及增殖。见图5、图6、表6、表7、图7。

图5 两组巨噬细胞及白细胞浸润(免疫组化染色,×200)

图6 在EGM-2培养4 d的BM源性c-Kit+细胞中表达c-Kit+和CD31+的原始细胞表面标志物(DAPI染色,×200)

表6 两组血浆sFlt1水平、Mac3+和CD45+细胞数量

表7 两组MPP-9和MMP-2的凝胶溶解活性及两组c-Kit+/CD31+细胞数量、迁移、侵袭和增殖

图7 两组c-Kit+细胞的迁移、侵袭(Diff-Quik染色,×200)

3 讨 论

本研究发现,缺血性应激促进了观察组小鼠肌肉组织中的炎性作用及Wnt5a/11和SC35和VEGF-A165b表达,并降低VEGFR2/Akt信号通路对缺氧应激反应。在体外,缺氧刺激观察组小鼠BM源性CD11b+巨噬细胞及VEGF-A165b表达,从而降低成熟内皮细胞和BM来源的巨噬细胞细胞功能;这可能导致老年动物血管重建受损。其潜在机制可能为衰老通过Toll受体2使巨噬细胞活化并分泌VEGF-A165b,其刺激Wnt5a/11-SC35表达增加从而损害了内皮细胞和内皮祖细胞的功能最终影响了血管新生。表明VEGF-A165b可能是老年小鼠缺血诱导新生血管形成的关键抗血管生成调节剂。

有研究表明,在病理条件下,炎症反应会加速衰老〔7〕。本研究与先前的研究一致〔4,7,25,26〕,心血管危险因素(如衰老)促进动物和人类的内皮祖细胞功能和数量下降〔7,16〕。 固有功能和血管祖细胞数量的下降可以成为老年缺血性新生血管损害的解释机制。值得注意的是,缺氧对BM来源的c-Kit+细胞中VEGF-A165b亚型表达没有影响。是否有其他病理因素影响其表达,并通过自身及其他细胞产生抗血管生成作用尚需进一步研究。

本研究存在一定局限性。首先,不能通过VEGF-A亚型抗体(尤其是抗VEGF-A165b抗体)来区分增加的VEGF-A成分。其次,对VEGF-A165b的基因研究并不能直接证明其在新生血管形成中的作用。