QuEChERS 提取快速液相色谱-串联质谱法同时测定食品中多种真菌毒素

赵淑娥，肖庚鹏，袁璐，芦慧，罗春丽

（江西省检验检测认证总院检测认证技术发展研究院，江西南昌，330029）

0 引言

真菌毒素是各种真菌菌核产生的毒性次级代谢产物，与真菌的生长发育无关且并非所有代谢物都有毒。一种真菌可产生多种毒素，多种真菌也可产生同一种毒素。其中，曲霉属、镰刀菌属和青霉属涵盖了绝大多数产毒菌。与曲霉属相关的主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A 等，与镰刀菌属相关的包括玉米赤霉烯酮、T-2 毒素、呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）和伏马毒素等，与青霉属相关的有展青霉素和桔青霉素等。毒性最大的是黄曲霉毒素（尤指AFB1），赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮次之。被这些毒素污染的食物、饲料进入食物链，会对人畜表现出致癌、遗传毒性和致畸性。如何准确快速测定真菌毒素已成为亟待解决的问题。

有关黄曲霉毒素（以AFB1 为例）的毒性及对人和动物健康危害的反应机理以及检测方法综述见文献［1］。不同国家对真菌毒素制定了不同的标准，包括不同食物中各类真菌毒素的限量及它们的测定方法标准［2］。国标［3］针对各类食品的AF、DON、ZEN、OTA 和PAT作了限量要求，并有相应检测方法。真菌毒素测定方法有薄层色谱法（TLC）、酶联免疫测定法（ELISA）、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱质谱联法（LC/MS）等。TLC 主要用于粗筛，ELISA适用于大批样品检测，胶体金免疫层析法适合现场单个或少数样品测定，HPLC 法专属性较强，LC/MS 法可以实现多成分同时检测，解决色谱不完全分离及假阳性的问题。QuEChERS 技术在食品真菌毒素检测中的研究进展得到了专题与综述报道［4，5］。QuEChERS 方法具有快速、简单、廉价、有效、可靠和安全的特点，在真菌毒素分析方面也得到普遍推广和应用。谷物中16 种真菌毒素采用直接提取加同位素内标的液相色谱质谱仪法测定［7］。

国标方法中不同真菌毒素对应不同的检测方法，全部测定所有毒素会耗费大量的人力、耗材和时间成本，也对操作人员增加了风险。本研究在保证高回收率的前提下，将检测方法统一，选择用QuEChERS 方法快速提取、净化和浓缩，通过同位素内标减少基质干扰，对食品中8 种真菌毒素同时进行了测定，有效地缩短了分析时间，节约了成本。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 6470B 超高效液相色谱- 串联质谱仪（配备Agilent 1290 Infinity II Prime LC 液相色谱分离模块和安捷伦喷射流（AJS）电喷雾离子源，数据采集和定量分析采用Agilent MassHunter，美国Agilent 公司）；KQ5200E 型数字超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；飞鸽牌TDL-5-A 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；VORTEX GENIUS 3型涡旋混合器（德国IKA 公司）；氮吹仪，EFAAHM-01 型多管涡旋混合器（上海安谱实验科技股份有限公司）。

黄曲霉毒素B1（AFB1），氘代黄曲霉毒素B1（13C17-AFB1），黄曲霉毒素B2（AFB2），氘代黄曲霉毒素B2（13C17-AFB2），黄曲霉毒素G1（AFG1）， 氘代黄曲霉毒素G1（13C17-AFG1），黄曲霉毒素G2（AFG2）和氘代黄曲霉毒素G2（13C17-AFG2）均购于天津阿尔塔科技有限公司；脱氧雪腐镰刀烯醇（DON），氘代脱氧雪腐镰刀烯醇（13C15-DON），玉米赤霉烯酮（ZEN），氘代玉米赤霉烯酮（13C18-ZEN），赭曲霉毒素A（OTA），氘代赭曲霉毒素A （13C20-OTA），展青霉素（PAT）和氘代展青霉素（13C7-PAT）均购于青岛普瑞邦生物工程有限公司；甲醇，乙腈，正己烷（色谱纯）均购于美国默克股份联合公司；乙酸，乙酸铵（色谱纯），无水硫酸镁（分析纯）均购于上海安谱实验科技股份有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA），碳十八键合硅胶（C18）和石墨化碳黑（GCB）均购于月旭科技（上海）股份有限公司；实验用水为屈臣氏纯净水；实验样品为市场随机购买。

1.2 标准品制备

分别配置8 种真菌毒素单标储备液，其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON 和PAT 用乙腈作溶剂，ZEN和OTA 用甲醇作溶剂，所有内标溶液均用乙腈作溶剂。分别移取一定体积单标储备液于同一10mL 棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，配置真菌毒素混合标准工作液， 浓度（AFT、DON、ZEN、OTA、PAT） 为100~15000ng/mL，分别移取一定体积的稳定同位素单标储备液于同一10mL 棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，配置稳定同位素内标混合标准工作液，浓度（13C17-AFB1、13C17-AFB2、13C17-AFG1、13C17-AFG2、13C15-DON、13C18-ZEN、13C20-OTA、13C7-PAT）为1~200ng/mL，于 -20℃保存。

1.3 标准曲线溶液浓度

标准曲线溶液浓度（见表1）。

表1 8 种真菌毒素标准曲线溶液浓度

1.4 样品前处理

样品经粉碎机粉碎，过1mm 孔径试验筛，混匀，用四分法取样。称取5g（精确至0.01g）样品于50mL离心管中，准确加入20mL 乙腈-水-乙酸混合提取液（70：29：1，v/v/v），涡旋混合1min，超声（中途需摇匀数次）30min，然后以5000 r/min 离心5min。取8mL 上清液于预先加有50mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、50mg 碳十八键合硅胶（C18）、25mg 石墨化碳黑（GCB）和300mg 无水硫酸镁净化剂的10mL离心管中，涡旋2min，以5000r/min 离心2min。准确吸取4mL 上清液于10mL 比色管，40℃氮气吹至近干，用1mL 初始流动相（A+B=3+7）涡旋复溶后移入1.5mL 离心管中，以12000 r/min 离心5min。上清液过0.22µm 微孔滤膜，取180µL 滤液至400µL 内插管中，加20 µL 混合内标工作液涡旋混匀，供HPLCMS/MS 测定。

1.5 仪器条件

色谱条件。色谱柱：Phenomenex Luna C18（2）100?（150×2.0 mm ，3 µm）； 流动相：A 相为乙腈+甲醇（1+1），B 相为5 mmol/L 乙酸铵水溶液（含1 %乙酸）；梯度洗脱程序：0~2.0 min、95%B，2.0~2.1 min、95~60%B，2.1~7.0 min、60~50%B，7.0~10.0 min、50%B，10.0~12.0 min、50~45%B，12.0~15.0 min、45~10%B，15.0~15.5 min、95%B；流速：0.3 mL/min；柱温：35℃；进样量：2 µL。

质谱条件。电离方式：安捷伦喷射流（AJS）电喷雾电离，正离子、负离子切换模式；毛细管电压3.5kv（+），3.5kv（-）；雾化气：氮气，鞘气流速：11 L/min，鞘气温度：350℃，雾化器压力：45 psi，干燥气温度：350 ℃，干燥气，流速：11 L/min；扫描模式：多反应监测（MRM），8 种真菌毒素及其稳定同位素内标MRM 参数列表见表2。

表2 8 种真菌毒素及其稳定同位素内标MRM 参数列表

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

2.1.1 提取溶剂的确定

提取作为QuEChERS 法技术的关键步骤之一，其效果决定了分析结果的准确性和实用性。常用的提取剂乙腈、甲醇和丙酮，均有好的提取效果。对极性敏感的组分（如OTA 等）进行提取时需加入一定比例的甲酸或乙酸于提取液中，以提高其提取效率。对谷物中极性较强的组分（如DON）甲醇的提取率不如乙腈。丙酮与乙腈极性相似，且挥发性更强，易于浓缩，对黄曲霉毒素和OTA 提取率高，但不易与水分层，提取杂质较多且盐析效果差，基质干扰严重［4-6］。乙腈因其提取效率高，且与液质分析（LC/MS/MS）兼容性强而应用最广。经综合考虑，本研究采用乙腈-水-乙酸混合液（70：29：1，v/v/v）为提取剂。

2.1.2 净化材料（QuEChERS 法）的确定

样品经提取液提取后有大量共萃取物，通过盐析可初步去除部分水溶性杂质，针对中性和不同酸性体系［10］可采用不同的盐析剂。PSA 去除有机酸、脂肪酸、酚类和碳水化合物效果好，C18能有效去除油脂类杂质，GCB 对色素有较好的吸附。以无水硫酸镁作除水剂，经反复试验比较，PSA、C18、PSA+C18和PSA+C18+GCB，净化效果与文献［8，9］结论基本一致，PSA+C18净化效果最佳，故采用PSA+C18为净化材料，用QuEChERS 法处理。

2.2 色谱条件的优化

实验中比较了不同流动相对真菌毒素分离的影响，最终确定A 相为乙腈+甲醇（1+1），B 相为5 mmol/L乙酸铵水溶液（含1 %乙酸）。优化流动相梯度洗脱程序，优化后8 种真菌毒素响应度和分离度都得到了改善，且大大缩短了分析时间（见图1）。

图1 8 种真菌毒素总离子流图

2.3 方法的标准曲线及检出限

将8 种真菌毒素系列浓度在优化的色谱条件下上机测定，以待测组分的浓度为横坐标（X），响应峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归分析。以仪器3 倍信噪比（S/N=3）求出各组分仪器的检出限。8 种真菌毒素的线性方程、相关系数、线性范围、检出限见表3。由表3 可知，各组分的线性关系良好，相关系数r≥0.9984。

表3 8 种真菌毒素的线性方程、相关系数、线性范围和检出限

2.4 方法的回收率和精密度

在花生、玉米、薏米仁空白样品中以加标的方式进行回收率和精密度实验，分别加入低、中、高3个水平浓度，按1.4 项下的样品前处理方法处理后上机测定，每个加标水平平行测定5 次，计算方法的回收率和精密度。由表4 可知，加标平均回收率为70.1%~119%，相对标准偏差（RSD）为2.45%~9.97%，本方法具有良好的精密度。

表4 8 种真菌毒素的加标回收率和相对标准偏差（n=5）

3 样品测定

为验证本方法的实用性，本研究在市场上随机抽取了120 份样品，包括50 份花生、50 份玉米、20 份薏米仁，按照优化的提取条件和色谱-质谱条件进行前处理和上机测定。花生样品检出1 份阳性， AFB1、AFB2、AFG1、AFG2检出量分别为6.3µg/kg、3.8µg/kg、6.0µg/kg、4.4µg/kg；玉米、薏米仁样品各检出玉米赤霉烯酮（ZEN）1 个，检出量分别为11.3µg/kg、 70.6µg/kg。

4 结论

本着快速、操作简便、低成本的实验目标，本研究采用乙腈-水-乙酸（70：29：1，v/v/v）作提取溶剂和PSA、C18、GCB 混合固相分散净化剂进行前处理，建立了超高效液相色谱-串联质谱测定食品中的8 种真菌毒素的方法。该方法样品前处理简单方便、快速高效，灵敏度高，回收率高，重复性好，并成功应用于实际样品的检测。实验证明基质特别复杂的调味品（如胡椒、花椒、辣椒粉）因其严重的基质干扰不适用于本方法。