分散固相萃取耦合高效液相串联质谱仪测定赣南脐橙中矮壮素的残留

闵芳芳，袁璐，丁若雯，罗英，肖庚鹏*

（1. 江西省检验检测认证总院检测认证技术发展研究院，江西南昌，330052；2. 江西省药品检查员中心，江西南昌，330000）

0 引言

赣南脐橙产自江西省赣州市，是赣南地区的地理标志产品。赣南脐橙由于味美和营养丰富正受到越来越多人的青睐。赣南脐橙作为柑橘类水果，含有橙皮苷、芦丁、柚皮苷等黄酮类化合物，在中药中具有清热去火的效果。其中，橙皮苷能扩展支气管，具有清热化痰、疏郁理气、抗炎和抗过敏的功效，芦丁对高糖高脂饮食导致的小鼠肾脏损害具有保护作用［1-4］。

矮壮素（Chlormequat Chloride， CCC），是一种季铵盐类植物生长调节剂，主要用于小麦、水稻、玉米、水果等作物，以提高产量，改善品质［5］。矮壮素虽为低残留的农药，但是仍会引起人的中毒甚至死亡［6］。同时，还有研究表明，在低于日允许摄入量（ADI）水平下，矮壮素也会对动物的繁殖能力产生不良影响［7］。

目前，国内外对矮壮素残留的检测方法主要有液相色谱法、离子色谱法、气相色谱串联质谱法和液相色谱串联质谱法等，涉及食品［8］、肥料［9］、药材［10］等。然而，应用HPLC-MS/MS 法检测矮壮素在赣南脐橙中残留的方法未见报道，因此建立一个对赣南脐橙中矮壮素残留的快速准确的定性、定量分析的检测方法， 对真实反映其残留现状， 确保人们的食品安全有着至关重要的作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290 高效液相色谱仪， 配有G7120A 高压二元泵， G7129B 高性能自动进样器， G7116B 柱温箱；Agilent 6470B 高效液相串联质谱仪，配有电喷雾电离源 （AJS ESI）；数据采集和处理采用Mass Hunter 软件。TDL-5-A 离心机，上海安亭科学仪器厂；涡旋仪， 德国IKA；多孔振荡器，上海安谱实验科技股份有限公司。

矮壮素（1000μg/mL），天津阿尔塔科技有限公司；甲醇和乙腈（色谱纯），德国Merck 公司；甲酸（色谱纯），上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠和无水硫酸镁（分析纯），国药集团化学试剂有限公司 。PSA（分析纯），天津博纳艾杰尔科技有限公司；GCB（分析纯），上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水为屈臣氏蒸馏水。

1.2 标准溶液的配置

移取1.0 mL 上述标准品溶液， 置于100 mL 棕色容量瓶中， 用乙腈定容，配制成10.0 μg/mL 标准储备液，于-18℃下保存。

准确移取1.0 mL 标准储备液，置于10 mL 棕色容量瓶中，用50%（v/v）乙腈水溶液定容，配置成1.0μg/mL 标准使用液。取适量矮壮素的标准使用液，用50%（v/v）乙腈水溶液配置成质量浓度为0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L 的系列标准工作液。

1.3 样品前处理

称取约5 g（精确至0.0001）样品至50 mL 离心管，加入10 mL 乙腈，于2500 Hz 下震荡1 min，加入 4 g 无水MgSO4和1 g NaCl，于相同条件下震荡5 min 后，5000 rpm 下离心5 min。分取2 mL 上清液于10 mL 离心管中（内含300 mg 无水MgSO4、50 mg PSA、5 mg GCB），涡旋1 min，5000 rpm 下离心5 min，上清液过0.22 μm 有机滤膜供HPLC-MS/MS 分析。

1.4 色谱与质谱条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18 （100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱温： 30 ℃；进样量： 2 μL；流速： 0.3 mL/min；流动相： 乙腈 （A）和0.1%甲酸水 （B）， 梯度洗脱程序见表1。

表1 矮壮素梯度洗脱程序

1.4.2 串联质谱条件

离子源： 电喷雾离子源，正离子模式（AJS ESI+），多反应监测（MRM）扫描；干燥气温度：350℃；干燥气流速： 11 L/min；雾化器压力： 45 psi；鞘气温度：350℃；毛细管电压： 3500 V；电子倍增管电压： 500 V；定性离子对、定量离子对、驻留时间及碰撞能量见表2。

表2 矮壮素的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 LC-MS/MS 的优化

2.1.1 流动相的选择

少量甲酸可以增加化合物在正离子模式下的电离效率，有助于M 形成［M+H］+。基于此，本实验比较了乙腈-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，考察对目标化合物峰形及离子化效率的影响。结果表明，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，矮壮素的峰型更对称，且灵敏度更高。

2.1.2 质谱参数的优化

在正离子模式下，用浓度为1.0 μg/mL 的标准溶液进行全扫描确定母离子；确定母离子后，在SIM 模式下，对透镜补偿电压进行优化；然后在某一特定的碰撞能下，对已确定的母离子使其产生特定的子离子，选取丰度强且干扰小的两对子离子作为子离子，最后对碰撞能进行优化。矮壮素的一级和二级质谱图如图1。

图1 矮壮素的离子碎片图

图 2 不同提取溶剂对矮壮素提取率的影响 （n=3）

2.2 样品前处理优化

2.2.1 提取溶剂的选择

矮壮素是一种强极性农药，易溶于水、甲醇和乙腈等溶剂，因而本实验考察了甲醇和乙腈对矮壮素的提取效率。通过添加40 μg/kg 的矮壮素到阴性样品中，比较了用甲醇和乙腈作提取溶剂的提取率。结果显示，分别用甲醇和乙腈作为提取样品中的矮壮素，再经过分散固体剂净化，乙腈提取率（95.21%）比甲醇（51.42%）的更高（图2）。实验发现，与乙腈相比，用甲醇作为提取剂，使得提取液中色素等干扰物质越来越多，不利于后期的净化，增加了质谱的干扰。为了减少后续分析过程中的干扰成分，提高方法的灵敏度和准确度，本实验选择乙腈作为提取溶剂。

2.3 方法验证

2.3.1 基质效应

本实验选择赣南脐橙阴性样品配置质量浓度为5 μg/L、50 μg/L、100 μg/L 的基质标准溶液和纯溶剂的标准溶液，按照公式（1）计算基质效应，其基质效应如图3 所示。一般来说，基质效应<0.85 表现为基质抑制；基质效应>1.15，表现为基质增强；0.85 ≤基质效应≤1.15，基质效应可以忽略［11］。结果显示，用乙腈作为提取溶剂，5 μg/L、50 μg/L 和100 μg/L 的基质效应分别为95.68%、89.37%和97.04%，这说明矮壮素在低、中、高浓度下基质效应可以忽略，研究者可以用纯溶剂代替基质来配置标准曲线。

图3 不同浓度的矮壮素的基质效应 （n=3）

2.3.2 线性范围和检出限

在1.3 条件下对矮壮素标准溶液进行测定，以不同浓度的标准溶液为横坐标，不同浓度标准品溶液对应的峰面积为纵坐标进行线性回归，其线性方程为y=621.72x-780.85， 相关系数R2=0.9991。结果表明，矮壮素在0.1~200 μg/L 范围内线性关系良好。分别以3 倍信噪比 （S/N=3）和10 倍信噪比 （S/N=10）确定矮壮素的方法检出限 （LOD）和定量限 （LOQ），结果分别为0.06 μg/kg 和0.18 μg/kg。

本方法的检出限低、灵敏度高、线性关系良好， 适用矮壮素的定量分析。

2.3.3 准确度和精密度

在赣南脐橙阴性样品中添加低（10 μg/kg）、中（100 μg/kg）、高（200 μg/kg）3 个水平的矮壮素标准溶液，每个水平进行6 次平行实验，计算加标回收率和精密度，实验结果如表3 所示。结果显示，在3 个不同浓度水平下，赣南脐橙中矮壮素的平均回收率在90.29%~97.14%，相对标准偏差为1.29%~4.42%，完全满足GB/T 5009.219—2018 的精密度≤10%的要求。

表3 矮壮素的加标回收率和精密度（n=6）

3 结论

本研究建立了固体分散剂耦合高效液相串联质谱仪测定赣南脐橙中矮壮素的残留量的分析方法，方法简便、高效，灵敏度高，线性关系、准确度和精密度均满足方法学指标，可为对赣南脐橙中矮壮素残留的快速检测提供技术手段。