林木组织培养的褐化现象及控制途径

王梓默, 林士杰, 朱红波, 何怀江, 张大伟, 杨 帆

(1. 吉林省林业科学研究院, 吉林 长春 130033; 2. 吉林省林业调查规划院, 吉林 长春 130022)

作为以细胞全能性理论为基础的无性繁殖技术,植物组织培养具有能够保持母本优良性状、繁殖速度快等优势,对于有性繁殖难度大、扦插不易成活的林木繁殖具有重要的应用价值,目前已被广泛应用于离体快繁[1]、种质资源保存、脱毒苗木培育、遗传育种及物种保护等方面[2]。但在林木组织培养的过程中经常发生褐化现象,不仅影响外植体的生长,甚至可能直接导致培养物死亡,有效控制褐化已经成为林木组织培养成功率提高的关键[3-5]。本文概述了近年来林木组织培养褐化研究进展,总结了褐化的影响因素与控制途径,以期为木本植物高效组培技术体系的建立提供参考。

1 林木组织培养褐化的影响因素

关于林木组织培养褐化的原因主要集中于2类观点:第一种观点认为褐化主要是由过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等与底物酚类物质发生反应形成醌类物质,醌类物质经脱水、聚合产生黑褐色物质,使外植体及培养基褐化,导致树木生长受阻甚至死亡,即酶促褐化[6, 7];第二种观点认为组培过程中受不利外界条件的影响,造成了植物细胞程序性死亡,即胁迫褐化[8]。2种褐化问题发生机制的本质区别在于是否有酚类物质参与反应。林木组织培养褐化的发生,一方面与外植体的选择有关,主要指所取外植体本身的遗传特性、生理状态等;另一方面受开展组织培养的条件影响,既包括温度、光照等培养条件,也包括培养基的成分[9]。

1.1 外植体的遗传特性及生理状态

1.1.1 外植体的遗传特性

组织培养过程中褐化发生与树种类型和基因型有关,不同物种间褐化发生的情况不同。已有研究证明,酚酸、黄酮、单宁、木质素、色素等的含量与木本植物的褐化程度密切相关[10],这些物质含量较高的树种更容易发生褐化,如梨[11]、桃[12]、苹果[13]、银杏[14]、核桃[15]等木本植物更容易在组织培养过程中遇到褐变问题。不同品种间褐化也存在差异,与植物中所含酚类物质的数量、种类及酶活性不同有关。崔雪梅以同科不同属的暴马丁香、水曲柳作为试验树种,发现组织培养过程中水曲柳外植体发生褐变的概率明显高于暴马丁香,可能是由于水曲柳中多酚物质含量高于暴马丁香,同时暴马丁香中多酚氧化酶(PPO)的活性较低,降低了对酚类物质的氧化能力[16]。涂俊凡等对沙梨带芽茎段无菌培养过程中发现褐化差异与外植体的基因型相关,6个试验品种中“金水2号”较容易褐变,“圆黄”非常容易褐变,其余4个品种褐变程度明显较轻[17]。丁植磊等对12种油茶品种进行花药愈伤组织的诱导,发现虽然每个油茶品种均有褐化现象,但不同油茶物种间差别较大,其中红花油茶的褐化现象明显比白花油茶严重[18]。李新凤等的研究表明,牡丹组织培养时应注意基因型的选择,不同品种牡丹间组培褐化率差异显著,褐化程度较轻的“金阳”“金阁”和“赛雪塔”更适合做外植体[19]。

1.1.2 外植体的生长部位与生理状态

外植体的生长部位与生理状态也是影响组织培养褐化的主要因素。以同一树种不同部位器官作为外植体或以不同生理状态下的相同器官作为外植体时,树木的褐化情况也有所不同,常见外植体包括根茎的萌芽、根、腋芽和顶芽等。在台湾桤木[20]、陇东海棠[21]的组织培养过程中均发现以茎尖为外植体时褐变发生早,且褐化率及因褐化死亡率明显高于带芽茎段,带芽茎段是更好的外植体材料。杨兰芳以茶条槭当年生萌条的顶芽和带芽茎段为外植体进行初代试验,研究结果表明,带芽茎段与顶芽相比褐化严重,褐化率达20.35 %[22]。张继伟通过对10年生琵琶树幼嫩叶的叶柄及叶脉离体培养,发现随叶柄、中叶脉、上叶脉褐化率的增加,存活率及愈伤组织发生率依次降低,筛选出中叶叶柄为理想的培养材料[23]。喻娜的研究结果表明,银杏茎尖的幼嫩程度对其接种后褐化程度产生直接影响,以当年生相对幼嫩的嫩芽作为外植体褐化率明显高于枝条上的幼茎尖[24]。黄燕芬等对茶树组织培养外植体褐化的研究结果表明,保留带腋芽叶片2/5时能够缓解腋芽褐化现象,但需注意叶片消耗培养基养分的问题[25]。

外植体的大小也对褐化程度有一定影响。李圆圆通过对刺楸顶芽离体培养发现,较大顶芽作为外植体进行离体培养时褐化现象严重,褐化圈较大,相对较小的顶芽其褐化圈相对较小[26]。宋春晖等对柱状苹果进行离体培养时发现外植体茎段过长会增加污染率,同时导致萌芽率降低,选择带有2个腋芽的茎段作为外植体时生长效果最佳[27]。以不同材料为外植体时,其大小对褐化程度的影响也不同。张继伟等对琵琶树幼嫩叶进行离体培养时发现,叶片的大小对组培褐化率影响十分明显,其中大叶片的褐化率反而最低[23]。

取材季节和消毒时间也与外植体的褐变率关系密切。对茶树离体增殖与再生体系研究表明,秋季取材的污染率较高,一方面可能是由于春季腋芽刚萌生,自身携带的细菌相对较少,而秋季取材时腋芽已经经历较长时间的生长,携带的细菌增加,因此消毒相对更难;另一方面可能与春季茶树新梢中的多酚物质含量比秋季更低有关。因此,选择春季取材外植体的褐化率更低[28]。陈丽等对血皮槭快繁外植体褐化问题的研究发现,不同时间采摘的外植体褐化程度不同,在4—5月采摘的外植体褐化和分化均较少,而7—8月采摘的外植体褐化率较高,只有在6月采摘的外植体褐化少且分化高[29]。对刺楸茎椴进行离体培养时发现,接近夏季时取材,外植体的褐化现象较5月更加严重,诱导分化困难且污染率更高[26]。在对楸树、板栗、邓恩桉等愈伤组织诱导研究中发现,通过酒精、升贡等对外植体消毒处理时间过长时褐变率上升,萌芽率降低[30]。

1.2 培养基与培养条件

1.2.1 培养基的组分与形态

培养基是外植体的生长环境,其组分与形态都影响着外植体的褐化率。对桑树[31]、柿树[32]、苹果梨[33]、茶树[25]等进行组织培养研究发现,木本植物在1/2 DKW或者1/2 MS培养基上褐化程度减轻。对华盖木的组织培养研究发现,培养基硬度较高时褐化较轻,褐化死亡率降低[34]。当培养基中无机盐、蔗糖与大量元素浓度过高时会促进植物体细胞中酚类物质的合成,加剧外植体的褐化[8]。pH决定培养基的渗透压、影响酚类物质与多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)等的结合位点[35],当培养基pH过高时外植体更容易发生褐化[36]。植物生长调节剂的添加也对褐化产生影响,已有研究表明,在高浓度的外源激素作用下邓恩桉、巨桉带芽茎段诱导褐化率较高,降低激素浓度后褐化现象得到缓解[37]。同种激素对不同树种组培褐化影响不同,在紫杉芽诱导过程中添加6-BA后加剧了褐化,而在南方红豆杉组培过程中添加6-BA对外植体的褐化却起到了抑制作用[38]。此外,抗氧化剂与吸附剂也能够有效阻止褐化发生,其抑制褐化的作用在核桃[15]、桑树[31]、红豆杉[39]、华盖木[34]的组织培养过程中均得到了证实。

1.2.2 培养条件

温度影响多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)等的活性[40],与组织培养褐化现象紧密相关,在中华红叶杨组织培养过程中发现,高温时酶活性增强,褐化现象加剧[41]。雷樊登将接种后的茶树腋芽置于25 ℃和8 ℃条件下避光培养16 h后,再置于25 ℃条件下培养,发现温度升高明显促进了褐变,褐化率比低温培养褐化率高18.1 %[28]。但不同植物对温度的反应不同,已有研究表明,低温预处理能够显著影响水曲柳外植体发生数,但对于外植体褐变率的影响并不显著[42]。此外,光照也是影响褐化发生的主要培养条件之一,王晓丽等以直干桉超级苗茎段为外植体开展组培快繁技术研究,发现暗培养条件下外植体褐化率显著降低[43]。

2 林木组织培养褐化的控制途径

2.1 合适取材与优化处理

为了避免林木组织培养过程中褐化问题发生,首先应优化外植体的选择和处理。多项试验研究证明,多年生、木质化程度高的木本植物枝条与高度分化的组织更容易发生褐化,因此,外植体应尽量选择幼嫩植株上分生能力强的部位。取材时间应尽量避免夏季,在冬季或春季休眠期取材,枝条中酚类物质含量较低。不同品种、不同取材部位的外植体对消毒剂的耐受程度不同,应根据组培对象的生理特性与组织结构特点选择消毒剂类型、浓度与消毒时间,避免消毒时间过久加剧褐变[13]。Bonga等在巨桉组织培养过程中发现,取材切割产生的创面与体积之比越大时褐化现象越严重[38]。因此,在获取外植体时切口尽量平整,避免产生大面积创面。此外,在接种之前对外植体进行遮光、低温保存以及用无菌水冲洗也能降低褐变率[44]。

2.2 调整适宜的培养条件

创建适宜的培养条件能促进细胞脱分化和再分化,抑制褐化发生。通过调整培养基中无机离子、蔗糖以及生长调节剂适宜配比能减少褐化发生。在桑树和核桃组织培养过程中降低无机盐浓度后外植体的褐变率也随之下降[35, 45]。此外,在培养基中添加抗氧化剂与吸附剂也能减少褐化。常用的抗氧化剂包括柠檬酸、植酸、血清白蛋白、维生素C、维生素E、聚乙烯吡咯烷酮等,吸附剂包括活性炭、PVP等,通常吸附剂的使用浓度为0.1 %～0.5 %,根据不同的培养材料设计试验,筛选抑制褐变效果更好的抗氧化剂与吸附剂种类及浓度[46]。在不影响试材生长和分化的前提下,接种后可以通过降低温度、遮光培养、黑暗培养等方法抑制褐化。在木本植物组织培养过程中,可以根据培养材料的生理特性及褐化程度采用多种方法综合防控褐化现象的发生。张俊琦等在牡丹组织培养防止褐化的研究中发现,在培养基中添加吸附剂并结合暗培养,能够有效缓解褐化[47]。李婷婷等对不同基因型刺梨叶片愈伤组织的诱导结果表明,春季取材后在100 mg·L-1VC溶液中浸泡12 h,在培养基中添加2.0 g·L-1的柠檬酸或0.4 g·L-1的AgNO3可以有效控制叶片褐化的发生[48]。张俊林等对核桃茎段抗褐化研究发现,首先通过24 h的1～2 ℃低温处理,再用20 %的Na2S2O3溶液浸泡20～30 min后进行8～10 h的流水冲洗,在培养基中添加2.0 g·L-1PVP时外植体的褐化率达到最低[49]。

3 展望

褐化问题作为植物组织培养中的难题之一,不仅延长了组织培养的时间并提高了经济成本,同时制约着组织培养快繁技术在科研工作与实际生产中的应用。本文对林木组织培养过程中的影响因素进行总结与分析,针对性地提出了组织培养褐化的控制途径,不仅适用于预防褐变,同时适用于缓解已有褐化现象,为进一步开展高效林木组培技术研究提供参考。目前,无糖培养、开放式组培与开放式光自养微繁等新技术的研发为林木组织培养快繁技术的应用与发展提供了机遇,但组织培养技术自动化程度与国外相比仍有待提高。随着组织培养新技术的不断发展与完善,组织培养条件高度自动化调节将成为未来的主要研究方向,实现培养环境中光、温、气、水的自动化调控,能够有效控制褐化问题的产生,提高林木组织培养成功率,降低组培苗生产成本,对林木组织培养产业化发展具有重要意义。