miR-539抑制乳腺癌细胞MCF-7迁移的作用机制分析

孙煜曦,邓英姿,张美玲,张运峰,许 可,胡 芬

(1.华北理工大学 生命科学学院,河北 唐山 063210;2.唐山师范学院 生命科学系,河北 唐山 063000)

乳腺癌(Breast cancer)是女性多发恶性肿瘤之一,晚期癌细胞会随着淋巴管和血管向远端肝脏、脑、肺脏、骨组织转移,且转移过程是一个多基因参与调控的复杂过程[1]。已有文献报道转化生长因子β[2]、E-钙黏蛋白[3],基质金属蛋白酶[4]等多个基因与乳腺癌转移密切相关。目前,乳腺癌的转移机制已经有所了解,但仍有许多问题尚未解决。

microRNAs是一类长度约为19～25个核苷酸长度的内源性短链非编码RNA,其与靶基因的mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)序列结合,抑制靶mRNA翻译或促进mRNA降解,从而通过调节靶基因的表达来实现对生命活动的调控[5]。miR-539在多种癌症的发生发展中有着重要的功能,在前列腺癌中miR-539通过调节SPAG5的表达抑制其发展[6],在肝癌发生中miR-539通过靶向下调E2F3蛋白水平达到抑制癌细胞的增殖[7],miR-539还抑制非小细胞肺癌[8]细胞增殖并促进其凋亡。

本研究通过检测miR-539在乳腺癌细胞系中的表达,分析其对乳腺癌细胞迁移的影响,并进一步通过生物信息学分析其靶基因集合和信号通路及其在乳腺癌组织和正常组织间的表达差异,为深入研究miR-539在乳腺癌细胞发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 TCGA数据集分析miR-539在乳腺癌中的临床意义

采用TCGA数据在线分析工具(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/miR_path/index),获得miR-539的表达谱。

1.2 细胞培养

ZR-75-30、MDA-MB-231、T-47D和MCF-7乳腺癌细胞系培养在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.3 总RNA的提取和定量PCR

四种乳腺癌细胞总RNA的抽提和定量PCR参照胡芬等[9]的方法进行。

miR-539的检测引物如下:5′-GGAGAAAT TATCCTTGGTGTGT-3′(上游引物),5′-GTG CAGGGTCCGAGGT-3′(下游引物)。U6为内参基因,U6的检测引物如下:5′-CTCGCTTCG GCAGCACATA-3′(上游引物),5′-CGAATTT GCGTGTCATCCT-3′(下游引物)。

1.4 迁移实验

以7×104个MCF-7细胞/孔的密度接种于24孔细胞培养板中,待细胞密度达到80%～90%的时候,将miR-539 mimics、Negative Control、miR-539 inhibitor和microRNA inhibitor N.C(上海吉玛生物有限公司)转染到MCF-7细胞,转染和迁移实验参照胡芬等[9]的方法进行。

1.5 miR-539保守性分析

利用miRBase数据库下载Homosapiens(人)、Canisfamiliaris(家犬)、Equuscaballus(马)、Bostaurus(牛)、Macacamulatta(猕猴)、Musmusculus(小鼠)、Ovisaries(绵羊)、Pantroglodytes(黑猩猩)、Pongopygmaeus(猩猩)、Rattusnorvegicus(大鼠)10个物种的miR-539的成熟序列。采用MEGA7.0软件分析其保守性。

1.6 miR-539靶基因的预测

应用TargetScan7.1、RNA22-HSA及MIRDB靶基因预测软件对miR-539进行靶基因预测,取三者预测数据的交集再结合miTarbase中已经证实的靶基因形成靶基因集合用于后续分析。

1.7 KEGG分析

用KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)数据库对miR-539靶基因集合进行信号转导通路分析。

1.8 GEPIA分析靶基因集合在乳腺癌和正常组织中表达差异

采用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析miR-539靶基因集合在浸润性乳腺癌和正常乳腺组织中的表达差异。

2 结果

2.1 miR-539在乳腺癌细胞系中的表达

图1 qPCR检测乳腺癌细胞系中miR-539的表达

定量PCR实验结果发现miR-539在ZR-75-30、MDA-MB-231、MCF-7和T-47D四种乳腺癌细胞中均有表达,且在ZR-75-30细胞中表达量最高,在其它三种细胞的表达量相对较低(见图1)。

2.2 miR-539抑制MCF-7迁移

Transwell结果表明,在MCF-7细胞中,相对于对照组,过表达miR-539-mimics显著地抑制MCF-7迁移,过表达miR-539 inhibitor则促进MCF-7迁移(图2)。

图2 miR-539抑制MCF-7细胞迁移

2.3 miR-539的保守性分析

利用miRBase数据库下载了10个物种的miR-539的成熟序列,利用MEGA7.0软件分析其保守性,结果如图3所示。miR-539的成熟序列均是22个碱基,且碱基基本完全一致(绵羊和马除外),miR-539成熟序列在脊椎动物中具有高度的保守性。

2.4 miR-539的靶基因预测

采用TargetScan7.1、RNA22-HSA及MIRDB预测了miR-539靶基因,数量分别为6268、4674、547个,对3种预测方法的结果数据取交集后共获得172个靶基因。miTarbase数据库中记录的经双荧光素酶报告基因实验、western blot和qPCR方法证实的miR-539靶基因共有2个(Twist1和ZEB1),合计共获得174个靶基因用于后续的基因注释和通路富集分析(见图4)。

2.5 miR-539的预测靶基因的KEGG分析

miRNA的众多靶基因通常情况下会协同调控细胞信号通路。为了深入了解分析miR-539预测的靶基因和集中的174个基因,本研究采用KEGG经典通路数据库对miR-539的靶基因集合进行了信号通路富集分析。表1结果表明,miR-539的靶基因显著富集于RNA降解、雌激素信号通路等信号通路(P<0.01)。

表1 miR-539靶基因集合的KEGG富集分析

2.6 miR-539靶基因集合在乳腺癌中表达差异分析

GEPIA可用于分析来自TCGA和GTEx的9 736个肿瘤和8 587个正常样本的RNA测序表达数据[10]。本研究利用GEPIA分析了miR-539靶基因集合在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达,其中28个靶基因在乳腺癌中低表达(见图5A),14个靶基因在乳腺癌中高表达(见图5B),这42个基因可能与乳腺癌发生密切相关。

图5 GEPIA分析miR-539靶基因集合在乳腺癌和正常组织中的表达。相对于乳腺正常组织,在乳腺癌组织低表达的基因(A)和高表达的基因(B)

3 讨论

miR-539定位在人的14号染色体,已有文献报道miR-539在前列腺癌[6]、肝癌[7]、非小细胞肺癌[8]的发生发展过程中均发挥着重要的作用。本研究检测了miR-539在4种乳腺癌细胞系中的表达,并且迁移实验结果证明miR-539抑制乳腺癌细胞的迁移,表明miR-539可能具有抑制乳腺癌发生的作用。

microRNAs发挥功能是通过调控靶基因的表达来实现的,因此,找到microRNA的靶基因非常重要,但是microRNAs的靶基因寻找却非易事[11]。本研究通过多种生物学软件对miR-539的靶基因进行了预测,共获得174个靶基因,且这些基因主要参与细胞转运、RNA聚合酶启动子转录的正调节等生物学过程,为miR-539的功能研究提供了基础。

乳腺癌分为激素依赖型和非激素依赖型,在激素依赖型乳腺癌细胞中,雌激素通过雌激素受体促进乳腺上皮细胞增殖,进而促进雌激素受体阳性的乳腺癌细胞的生长[12],本研究通过对miR-539的靶基因集合进行了KEGG信号通路分析,结果发现miR-539主要富集在雌激素信号通路,由此推测miR-539的功能与乳腺癌发生密切相关。

通过分析174个靶基因在TCGA和GTEx样本中转录过程发现,与正常组织相比,乳腺癌组织中的GBRC5B、MAP1B等28个基因低表达,HNRNPF、TMEM等14个基因高表达基因,缩小了乳腺癌发生过程中miR-539的调控靶基因的范围,为阐明miR-539在乳腺癌发生中调控机制奠定了基础。