甘草次酸差向异构体的HPLC检测方法研究

2024-01-05张博冉武秋颖惠连旺刘会娟

唐山师范学院学报 2023年6期

关键词：次酸高氯酸氨水

张博冉,武秋颖,相林,惠连旺,刘会娟,许可

1.唐山师范学院生命科学系,河北唐山 063000;2.迈巴克(河北)药业有限公司,河北唐山 063000;3.北京理工大学化学与化工学院,北京 100081)

1 引言

目前已知的来自甘草的天然产物超过400种,包含70余种三萜类化合物以及300余种黄酮类化合物[1-3]。三萜类化合物是甘草中的重要成分,具有含量高、生理活性强的特点[4-7]。

甘草次酸(GA)作为甘草酸的苷元,经两步连续糖基化可以生成甘草酸(GL)[2,8,9]。

由于母核18位手性碳原子(C-18)构型的不同,自然界的GA存在两种差向异构体,即18α-甘草次酸(18α-GA)和18β-甘草次酸(18β-GA)[10-16](如图1所示)。

早期报道的测定两者的方法有TCL法和GC法[17],TCL法灵敏度较低,而GC法需要进行复杂的衍生化。现行国家标准中尚未收载18α-GA和18β-GA的分析测定方法。近年来,陆续有报道HPLC法测定甘草酸差向异构体,但这些方法中,有些流动相使用磷酸盐缓冲液,有些使用特殊色谱柱(例如苯基色谱柱)等,适用性较差[18,19]。

本研究采用C18色谱柱建立HPLC法同时测定18α-GA和18β-GA的含量。流动相为甲醇:10 mmol/L高氯酸水溶液(氨水调pH=8.2)(78:22v/v),流速1 mL/min。在上述条件下进样测定,18α-GA和18β-GA分离度较好,并且能够稳定检测压力,该检测法专属性强,准确度高,可用作甘草原料或基因工程菌株产物中差向异构体的含量测定。

2 材料与方法

2.1 仪器

Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪,包括四元泵、全自动进样器、柱温箱和紫外检测器。

2.2 试剂

18α-GA标准品(>98%)和18β-GA标准品(>99%)购自美国Sigma公司,甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯,试验用水为超纯水。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取18α-GA和18β-GA对照品各50 mg,分别置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液2 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。

2.4 HPLC检测

2.4.1 HPLC检测方法

检测波长254 nm,流动相A为甲醇,流动相B为10 mmol/L高氯酸水溶液,氨水调pH=8.2(二者体积比为78∶22 v/v),流速1.0 mL/min,进样量10μL。

2.4.2 线性关系及最低检测限方法

将对照品贮备液用流动相稀释成浓度为100,80,60,40,20和10 mg/L的系列标准溶液,按2.4.1所述方法检测。

2.4.3 精密度试验和重复性试险

分别取浓度为20 mg/L的18α-GA和18β-GA对照品溶液,按2.4.1所述方法连续进样5次,计算RSD。

3 结果与分析

3.1 检测条件摸索

C18反相色谱柱,4.6 mm×250 mm,粒径5 μm;检测波长254 nm,柱温:30℃,进样量:10 μL。流动相,甲醇:20 mmol/L高氯酸水溶液(氨水调pH=8.2)(75:25 v/v),流速1.0 mL/min。在上述条件下进样测定,18α-GA和18β-GA分离度较好,保留时间分别为24.189 min和26.456 min(图2)。实验中发现高氯酸浓度偏高,导致每检测5-6个样品,色谱柱压力就急剧升高,不得不进行冲洗柱子降低压力后才能继续检测。

图2 HPLC检测18α-GA和18β-GA

进一步优化HPLC检测条件为,流动相甲醇:水(10 mmol/L高氯酸氨水调pH=8.2)(75:25 v/v),流速1.0 mL/min。在上述条件下进样测定,18α-GA和18β-GA分离度较好,保留时间分别为27.690 min和29.125 min,并且能够稳定检测压力(图3),但检测时间过长,每个样品至少需要40 min左右。

图3 HPLC检测18α-GA和18β-GA

再次优化HPLC检测条件为,流动相甲醇:水(10 mmol/L高氯酸,氨水调pH=8.2)(78:22v/v),流速1.0 mL/min。在上述条件下进样测定,18α-GA和18β-GA分离度较好,并且能够稳定检测压力,保留时间分别为11.321 min和12.865 min(图4),因此采用该方法进行后续检测。

图4 HPLC检测18α-GA和18β-GA

3.2 线性关系及最低检测限考察

采用2.4.2所述方法各取溶液上样并记录色谱图。分别以18α-GA和18β-GA的溶液浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归,得到两者的回归方程,分别为y=36.989x+235.68,R2=0.990 7;y=36.049x+71.149,R2=0.997 5。结果表明18α-GA和18β-GA浓度为10～100 mg/L范围内线性关系良好。