InnowaveDX MTB/RIF对结核分枝杆菌复合群及利福平耐药检测性能的评估

刘梅 吴霞 古旭 李娜娜 张万敏 张小可 兰远波

对结核病进行早期诊断并开展有效治疗,是阻断结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)传播,遏制结核病发病和耐药的重要手段。针对 MTB病原体及其耐药性检测,临床常采用PCR技术,特别是GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)技术[1]。该种检测技术能够快速、高效完成 MTB和利福平耐药检测,为世界卫生组织所推荐常规使用[2]。但Xpert对硬件水平要求高、检测成本高,使其在临床广泛应用受到了限制,尤其在结核病发病率较高的发展中国家[3]。InnowaveDX MTB/RIF(简称“InnowaveDX”)检测是一种自动化分子诊断系统,该检测技术是在实时荧光定量核酸检测方法的基础上开展的,采用IS6110和rpoB双靶基因组合检测,能够同时检测MTB和利福平耐药性。此外,InnowaveDX检测适用于不同类型样本,在缩短了检测时间的同时,检测通量可以满足不同层级实验室的诊断需求。本研究中,笔者评估了InnowaveDX检测不同标本中结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)DNA和利福平耐药性的效能,现将结果报道如下。

资料和方法

一、研究对象

1.研究对象:采用前瞻性研究方法,连续纳入2023年3月1日至6月30日遵义医科大学附属医院具有结核病相关体征/症状,或胸部X线检查结果提示疑似结核病的患者作为研究对象,共107例,排除3例(含涂片和培养结果均不明确2例,InnowaveDX 结果不明确1例),最终纳入104例。研究对象中,93例诊断为结核病(包括肺结核88例,泌尿系结核2例,结核性脑膜炎1例,胸椎结核1例,淋巴结结核1例),其中68例经病原学阳性确诊,25例病原学阴性经临床诊断确诊;11例临床诊断为非结核病,其中10例无结核病病史(包括肺部恶性肿瘤2例,慢性阻塞性肺疾病3例,支气管感染1例,肺部感染、肺炎4例),1例有结核病病史(本次诊断为肺炎)。

2.入组标准:(1)结核病诊断:①病原学诊断:参照《WS 288—2017 肺结核诊断》[4],具有结核病临床表现,病原学诊断依据。本文中病原学诊断依据涂片显微镜检查和培养结果,即涂片阳性和(或)分枝杆菌培养阳性(经鉴定为 MTBC)。②临床诊断:无病原学依据,参照《WS 288—2017 肺结核诊断》[4],具有结核病临床表现、具备结核病影像学表现,排除肺部其他疾病。(2)非结核病:主要指肺炎、肺癌等易混淆疾病,均按相应疾病的诊断标准进行诊断,并经临床诊断及鉴别诊断最终确诊。

3.排除标准:(1)近期接受抗结核治疗;(2)最终诊断结果不明确;(3)同一患者的重复样本;(4)采集样本量<3 ml。

二、检测方法

1.标本采集:结核病组采集标本类型包括痰液71份,支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)16份,尿液2份,胸腔积液1份,脓液1份,淋巴穿刺液1份,脑脊液1份。非结核病组采集了痰液8份,BALF 3份。标本送至医院临床实验室进行处理,参照《结核病实验室检验规程》[5]对所有标本同时进行Xpert检测、InnowaveDX检测、涂片显微镜检、培养。

2.Xpert检测:严格按照美国Cepheid公司Xpert MTB/RIF说明书操作,前处理管中以1∶2加入标本和样本处理液,漩涡振荡10 s,室温静置15 min,取1 ml标本充分液化后,加入Cartridge试剂匣,上机检测。按照说明书进行结果判读:(1)至少2条探针循环阈值(Ct值)≤38,则表示检测到MTB;(2)当5条探针的Ct值均≤38,且早期Ct值和晚期Ct值之差<3.5,代表 MTB 检出同时对利福平敏感;(3)5条探针中有1条或者多条探针阴性,或虽5条探针的Ct值均≤38但早期Ct值和晚期Ct值之差≥3.5,代表标本中的MTB的探针相对应的rpoB基因片段发生突变,即利福平耐药检出。对于MTB阳性的样本,Xpert系统会根据Ct值给出MTB载量,分级包括高(Ct值<16)、中(Ct值为16～22)、低(Ct值为22～28)和极低(Ct值>28)。

3.InnowaveDX检查:产品为苏州创澜生物科技有限公司生产。根据产品说明书进行操作,取1 ml 标本加入前处理管中,并依次向前处理管中加入6 ml含胍盐的裂解液和150 μl内参,充分混合后超声处理5 min;将超声处理后的样品放入配套的核酸提取仪中进行核酸提取,转移25 μl的提取产物至反应管A和反应管B中,用荧光定量PCR仪(SLAN-96S全自动医用PCR分析系统,上海宏石医疗科技有限公司)进行扩增。按照说明书进行结果解读:(1)IS6110基因 PCR 扩增结果Ct值小于等于说明书规定的 Cutoff值,表明检测到MTBC的目标DNA,即MTB阳性;反之即MTB阴性;(2)InnowaveDX为MTBC及利福平耐药基因突变检测的双功能试剂,仅在 MTB检出的情况下,报告利福平耐药突变检测结果。当5条位于rpoB基因RRDR区域探针中任意1条探针与位于rpoB基因RRDR区域之外的非突变区域探针的ΔCt值大于等于说明书规定Cutoff值,表明检测到标本中的MTB利福平耐药相关的rpoB基因突变,即对利福平产生了耐药;反之,则表明未检测到标本中的MTB利福平耐药相关的rpoB基因突变,即对利福平敏感。不同于Xpert,此方法无MTB菌载量与Ct值之间的相关定义。

4.涂片显微镜检及培养:参照《结核病实验室检验规程》[5]进行涂片萋-尼抗酸杆菌染色显微镜检及固体培养。

三、统计学处理

采用 SPSS 24.0软件进行数据的统计分析。计数资料以“百分率(%)”描述,组间差异的比较采用χ2检验、配对χ2检验及Fisher精确概率法,以P<0.05为差异有统计学意义。分析各检测方法的检测效能,各指标计算公式:敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%;特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%;阳性预测值=真阳性数/(真阳性数+假阳性数)×100%;阴性预测值=真阴性数/(真阴性数+假阴性数)×100%;一致率=(真阳性数+真阴性数)/(真阳性数+真阴性数+假阴性数+假阳性数)×100%;一致性分析采用Kappa检验,Kappa值>0.80为一致性好,Kappa值为0.40～0.80为一致性良好,Kappa值<0.40为一致性较差。

结 果

一、InnowaveDX和Xpert对结核病的诊断价值比较

以病原学和临床诊断为参照标准,InnowaveDX检测结核病的敏感度、特异度、一致率、Kappa值分别为92.5%(86/93)、100.0%(11/11)、93.3%(97/104)、0.72;Xpert检测结核病的敏感度、特异度、一致率、Kappa值分别为93.6%(87/93)、100.0%(11/11)、94.2%(98/104)、0.75(表1)。

表1 InnowaveDX和Xpert对结核病的检测效能

在病原学阳性结核病组中,InnowaveDX 检测阳性率为 97.1%(66/68),Xpert检测阳性率为95.6%(65/68),两种技术检测阳性率差异无统计学意义(χ2=0.000,P=1.000)。在病原学阴性结核病组中,InnowaveDX检测阳性率为80.0%(20/25),Xpert检测阳性率为88.0%(22/25),两种技术检测阳性率差异无统计学意义(χ2=0.149,P=0.700)。

二、InnowaveDX和 Xpert对不同标本的检测价值

93例结核病患者标本中,痰标本71份(76.3%),其他类型标本22份(23.7%)。InnowaveDX和Xpert检测痰标本阳性率均为91.5%(65/71),差异无统计学意义(χ2=0.000,P=1.000)。InnowaveDX和Xpert检测其他类型标本阳性率分别为95.5%(21/22)和100.0%(22/22),差异无统计学意义(Fisher精确概率法,P=1.000);InnowaveDX未检出的1份标本为BALF标本。

三、InnowaveDX与Xpert对利福平耐药的检测价值

93份结核病患者标本中,InnowaveDX和Xpert检测MTBC均报告“检出”的标本有85份,其中1份Xpert检测“利福平耐药”结果为“不明确”,故最终纳入84份标本进行利福平耐药检测效能分析。以Xpert检测MTB利福平耐药性结果为参照,InnowaveDX检测MTB利福平耐药的敏感度为97.0%,特异度为92.2%,Kappa值为0.88,一致性较好(表2)。

表2 InnowaveDX和Xpert对结核分枝杆菌利福平耐药性的检测效能

讨 论

随着检测技术的不断发展和增容,基于核酸扩增试验、核酸分子杂交和基因测序的结核病分子诊断技术得到了飞速发展,其发展也极大地推动了结核病的病原学诊断和快速药物敏感性分析的进步[6]。在我国,针对结核病实验室诊断,大多依靠涂片抗酸杆菌染色显微镜检的方式,但是由于该方法对标本的含菌量有着较高的要求,因此,在诊断过程中出现敏感度较低的结果[7]。分枝杆菌培养,近年来也在基层医院开展,但是由于培养耗时较长,不利于快速诊断。基于核酸检测的分子生物学方法中,Xpert能够达到较高的检测敏感度,同时能够在分子水平快速诊断利福平耐药,然而其缺点在于依赖进口仪器及试剂,仪器维修维护及试剂成本均较高,限制了其在国内的广泛应用。相比于涂片抗酸杆菌染色显微镜检和培养方法,InnowaveDX是一种快速、简单、经济、有效的检测方法,其采用自动化分子诊断系统,可在原始样本中同时定性检测MTBC和MTB利福平耐药相关rpoB基因突变,3 h内即可完成检测,大大节省了检测的时间,且通量灵活,检测效能与Xpert的一致性较好[8],可以满足不同层级实验室的诊断需求。

本次研究中,以病原学和临床诊断为参照标准,InnowaveDX检测结核病的敏感度、特异度、一致率、Kappa值分别为92.5%、100.0%、93.3%、0.72;Xpert检测结核病的敏感度、特异度、一致率、Kappa值分别为93.6%、100.0%、94.2%、0.75。在病原学阳性结核病组中,InnowaveDX 检测阳性率为 97.1%,Xpert检测阳性率为95.6%,差异无统计学意义;在病原学阴性结核病组中,InnowaveDX检测阳性率为80.0%,Xpert检测阳性率为88.0%,差异无统计学意义。可见,InnowaveDX对MTBC有较好的检测效能。

另外,本研究纳入的93份结核病患者标本中,除痰标本外,还包括BALF、尿液、胸腔积液、脓液、淋巴穿刺液及脑脊液,InnowaveDX检测结核病患者痰标本和其他类型标本的阳性率分别为91.5%和95.5%,与Xpert检测结果(分别为91.5%和100.0%)差异无统计学意义。这说明,InnowaveDX与Xpert对于结核病患者不同类型标本的检测价值相似。

耐多药结核病仍是全球关注的问题。针对结核病开展有效诊治的关键在于对耐药结核病的快速诊断。耐药诊断的方法中,表型药物敏感性试验(简称“表型药敏试验”)是诊断耐药的金标准,但其检测周期长。因此,基因型药敏检测如Xpert检测,目前成为了诊断耐药结核病的一种常用的方式,并且该种方式在临床中被广泛使用[9-10]。本研究显示,以Xpert检测MTB利福平耐药性结果为参照,InnowaveDX 检测MTB利福平耐药的敏感度为97.0%,特异度为92.2%,两种方法检测结果的一致性较好(Kappa值为 0.88)。

综上,InnowaveDX对于MTBC具有较好的检测效能,且适用于不同类型的标本;另外,在MTB利福平耐药检测方面,以Xpert检测结果为参考,也显示了较好的检测效能;加之其具备的检测周期短、成本低、通量灵活的优点,显示出其具有在结核病病原学检测及耐药性检测方面的推广应用价值。值得注意的是,碍于本次研究样本量的限制,尤其作为对照组的非结核病患者例数较少,因此,本次研究结果存在一定的局限性,有待后续扩大样本量进一步验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献刘梅:酝酿和设计实验、起草文章、统计分析;吴霞和古旭:采集数据;李娜娜:分析/解释数据;张万敏和张小可:实施研究;兰运波:酝酿和设计实验、对文章的知识性内容作批评性审阅、指导