一种基于过氧化物模拟酶活性快速检测过氧化氢的方法*

程晓宏，杨 娟，张卫兵

（南通市疾病预防控制中心，江苏 226007）

过氧化氢（H2O2）有极强的氧化能力，具有漂白、消毒、氧化、防腐等作用，广泛用于食品安全和环境保护中[1-2]。过量过氧化氢对机体有害，我国国家标准禁止食品中检出过氧化氢残留。目前快速检测过氧化氢的方法主要有碘量法[3]、钛盐比色法[3]、电化学法[4]、荧光法[5-6]、过氧化氢酶法[7-8]、血红素类似物模拟酶法[9]、纳米粒子模拟酶法等[7-8，10]，这些方法或使用昂贵的生物酶、危险的强酸试剂，或需要复杂的仪器设备和合成工艺等，因此构建快速、低成本和高灵敏度检测过氧化氢的方法十分必要。

天然酶具有高催化性能、高选择性等优点，但存在易失活、稳定性差、成本较高和不易制备等缺点，因而应用受限。本文提供一种快速高效、构建简单和廉价易得的检测过氧化氢方法，可应用于食品安全和环境保护等领域，报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 圆二色谱仪（Jasco J-815，日本），电子分析天平（XS205，瑞士梅特勒公司），分光光度计（TU1901，北京普析通用公司），数显恒温水浴锅（DK-S26，上海精宏实验设备公司），微量台式离心机（WIGGENS BIOCEN 22R，维根技术北京公司），超纯水机（Milli-Q，密理博上海公司）。30% H2O2、Tris（三羟基氨基甲烷）、NaCl、HCl、KCl、底物ABTS［2，2’-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐］、二甲基亚砜、Triton X-100 表面活性剂均为分析纯。实验用二级纯水由Millipore 纯水仪制备。G4-DNA EAD4 序列为5’-CTG3（TTG3）3A-3’[11]。

1.2 溶液配置

1.2.1 缓冲溶液：称取1.2114 g Tris、0.7455 g KCl、2.925 g NaCl 于1 L 烧杯中，加入800 mL 水溶解，稀盐酸调节pH 至7.5，加入400 μL Triton X-100，加水补充至1 L，转移至1 L 玻璃瓶中，得到含20 mmol/L pH 7.5 Tris/HCl，20 mmol/L KCl，150 mmol/L NaCl，0.04% Triton X-100 的缓冲液。

1.2.2 G4-DNA 溶液：按照说明书要求，用1.2.1 缓冲液（1.0 mL）溶解G4-DNA（2 OD），并在95 ℃水浴加热10 min 后迅速用冰冷却至室温，浓度为10 μmol/L，4 ℃静置过夜，备用。

1.2.3 氯化血红素（hemin）溶液：二甲基亚砜溶解适量的hemin 可得10 mmol/L 储备液，-20 ℃以下可保存3 个月，临用前用缓冲液稀释成20 μmol/L hemin工作液。

1.2.4 过氧化物模拟酶构建：将1.2.2 中的G4-DNA溶液与1.2.3 中的hemin 溶液等体积混合，室温孵育，疏水作用即可获得过氧化物模拟酶（浓度为5 μmol/L）。

1.2.5 底物ABTS 溶液制备：用缓冲液配置10 mmol/L ABTS 工作液，4 ℃棕色瓶保存备用。

1.2.6 过氧化氢溶液标准系列配制：临用前，取质量分数为30%过氧化氢溶液，先用纯水稀释100 倍，再用缓冲溶液稀释成0、0.3、0.6、1.5、3.0、9.0、30.0、60.0 mg/L 工作曲线标准溶液。

1.3 圆二色谱试验 测量所用缓冲液为20 mmol/L pH 7.5 Tris/HCl，20 mmol/L KCl，150 mmol/L NaCl，0.04%Triton X-100，DNA 浓度为4 μmol/L，hemin 浓度为2 μmol/L。采用400 μL 1 cm 比色皿，在220～320 nm 范围内扫描收集圆二色谱（500 nm/min）。所得圆二色谱均为平滑处理、扣除背景、浓度校准后的结果。

2 结果

2.1 圆二色谱图谱 G4-DNA EAD4 在缓冲液中以平行/反平行共存结构，当加入hemin 后EAD4 形成更多的分子内平行结构，而反平行共存结构明显减少（图1）。

图1 EAD4 及复合物圆二色谱

2.2 检测条件选择 由图1 可知，hemin 诱导平行/反平行共存结构EAD4 形成平行结构，使得EAD4/hemin 模拟酶具有更高的稳定性和酶活性。因而仍选EAD4/hemin 浓度比2∶1[11]。1.2.4 中过氧化物模拟酶浓度为5 μmol/L，以1 cm 比色皿为降解反应池，较合适的总体积为2 mL 左右，比较0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 μmol /L 终浓度过氧化物模拟酶对降解反应的影响。较小浓度（0.1、0.2 μmol /L）过氧化物模拟酶催化反应所需时间较长，较大浓度（1.0、2.5 μmol /L）降解所需时间较短，催化效果太好，不易区分过氧化氢浓度，故选择中等浓度0.5 μmol /L 过氧化物模拟酶用于降解反应。

EAD4/hemin 模拟酶的过氧化物酶活性较强，反应3 min 即可观察到颜色变化，可用于定性筛查过氧化氢；反应5～15 min 后颜色基本稳定，可用于半定量分析过氧化氢；反应超过20 min 后颜色可能会因为过量的过氧化氢漂白而褪色。故选择催化反应3 min 用于快速定性筛查，催化反应5 min 用于半定量分析。

2.3 定性筛查过氧化氢 取100 μL 5 μmol/L EAD4/hemin 过氧化物模拟酶、100 μL 2 mmol/L ABTS 底物于比色皿中，分别加入1.8 mL 30 mg/L 过氧化氢标准溶液，反应3 min 后肉眼可观察到空白与过氧化氢溶液颜色的差异（图2）。

图2 过氧化氢模拟酶快速筛查过氧化氢

2.4 半定量分析过氧化氢 取100 μL 5 μmol/L EAD4/hemin 过氧化物模拟酶、100 μL 2 mmol/L ABTS 底物于比色皿中，分别加入1.8 mL 过氧化氢标准溶液系列（0.3、0.6、1.5、3、9、30、60 mg/L），反应3 min 后肉眼观察30 mg/L 与60 mg/L 浓度过氧化氢的体系溶液颜色相近，反应5 min 后肉眼观察0.3 mg/L 与0.6 mg/L 浓度过氧化氢的体系溶液颜色相近。因而舍弃0.3 mg/L 和60 mg/L 两个过氧化氢浓度点，将其他浓度过氧化氢反应后的溶液作为标准比色卡色阶（图3），用于过氧化氢半定量分析。

图3 过氧化氢模拟酶半定量分析过氧化氢标准色阶图

2.5 定量分析方法的工作曲线、 检出限、 精密度用分光光度计检测底物ABTS 氧化产物自由基阴离子（ABTS-，414 nm）吸光度，结果显示过氧化氢在0.3～30.0 mg/L 范围内线性较好，其线性回归方程为y=0.0277x+0.046，相关系数r=0.9996。以3 倍空白偏差除以回归方程斜率求得检出限为0.1 mg/mL。平行7 次测定1.0 mg/mL H2O2，相对标准偏差（RSD）为2.9%。

2.6 干扰实验 采用1.0 mg/mL H2O2对雨水中可能存在的Ca2+、Mg2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Cd2+、Fe3+、Al3+、Zn2+、SO42-、NO3-、PO43-、Cl-等常见的离子和食品中可能存在的苯甲酸、山梨酸、叔丁基对苯二酚等常见的防腐剂和抗氧化剂进行考察，均未发现明显干扰。食品饮料中的亮蓝、柠檬黄、苋菜红等色素添加剂和苏丹红、罗丹明等违禁染料会干扰目视半定量分析，但不影响光度计定量分析。

2.7 样品分析

2.7.1 阳性泡椒凤爪过氧化氢检测：称取粉碎均匀的可食部分试样1 g（精确到0.01 g），加2 mL 缓冲液摇匀，静置3 min 后进行定性筛查和半定量分析。如图4A 所示，泡椒凤爪中含有少量过氧化氢残留，溶液浓度约为1.5 mg/L（定量分析为1.30 mg/L），泡椒凤爪过氧化氢含量约为3 mg/kg（定量分析为2.60 mg/kg）。

图4 过氧化氢模拟酶快速筛查和半定量分析

2.7.2 污染地区雨水过氧化氢检测：量取50 mL 污染地区雨水，静置3 min 后进行定性筛查和半定量分析。如图4B 所示，该雨水中含有少量过氧化氢残留，溶液浓度约为0.6 mg/L（定量分析为0.64 mg/L），雨水过氧化氢含量约为0.6 mg/kg（定量分析为0.64 mg/kg）。

2.8 回收率实验 同时做空白试验、方法对照和加标回收试验，结果显示回收率96.0%～102.6%，说明可靠性较好。见表1。

表1 测定7 次凤爪、雨水、自来水中过氧化氢定量分析结果 mg/kg

3 讨论

分子内平行结构的G4-DNA 与hemin 孵育构建的模拟酶具有很强的过氧化物酶活性[11]，因而可用于快速检测过氧化氢。G4/hemin 复合模拟酶在弱碱性环境下有较高活性，因此，接近人体液pH 7.5被选择用于分析。由于分子内平行结构G4 上下两端具有疏水环境，可与疏水性的hemin 形成π-π 堆积，且G4 与hemin 最佳浓度比为2∶1[11]。

本文建立的基于过氧化物模拟酶快速检测过氧化氢的方法构建简单，只需G4-DNA 与hemin 室温孵育；G4-DNA 可通过DNA 合成仪大量合成获得，试剂成本不高；整个分析时间较短，反应时间仅需3～5 min，常温下即可进行，可肉眼快速定性筛查，可通过比较标准色阶卡半定量分析，也可通过光度计精确定量。该方法具有构建简便、灵敏度高，重现性好等优点，值得推广应用。