鲍鱼冷藏期间内源酶对质构特性的影响

范 映 辰, 于 曼 曼, 倪 众, 周 大 勇,3,4, 刘 玉 欣,3,4

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034;2.安徽农业大学 茶与食品科技学院, 安徽 合肥 230036;3.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心, 辽宁 大连 116034;4.大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

鲍鱼内收肌(腹足)是鲍鱼的可食用部分,蛋白质含量丰富,主要由肌原纤维蛋白(myofibrillar proteins,MPs)和胶原蛋白组成,两者的紧密结合使其具有独特的质地特性[1]。在加工贮藏过程中,二者的相对含量和物理化学性质的变化与鲍鱼内收肌的质构特性密切相关[2]。

新鲜鱼类、贝类等水产品在捕捞后的储运过程中,很容易因内源酶作用而变质[3]。贝类中广泛存在天冬氨酸蛋白酶(AP)、半胱氨酸蛋白酶(CP)、丝氨酸蛋白酶(SP)和基质金属蛋白酶(MMP)等内源性蛋白酶,且在低温下仍具有活性,它们可以通过水解肌肉蛋白导致贝类软化[4]。近年来,相关研究主要集中于鱼类、扇贝等水产肌肉食品,而对于鲍鱼研究较少。鲍鱼的肌原纤维和肌浆部分都存在降解肌原纤维的SP和MMP,而AP和CP存在于溶酶体中,通常在较低的pH下发挥作用[5]。因此,控制内源性蛋白酶对鲍鱼蛋白质的降解作用是保持贮藏过程品质的关键。

以鲍鱼腹足内收肌为研究对象,使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂,反式环氧丁二酰-L-亮氨酸氨基(4-胍基诺)丁烷(E-64)、基质金属蛋白酶抑制剂,1,10-菲罗啉水合物(1,10-phe)和丝氨酸蛋白酶抑制剂,苯基甲基磺酰氟(PMSF)等3种蛋白酶抑制剂处理鲍鱼,测定鲍鱼冷藏过程中持水能力、结构蛋白、微观结构及质构的变化及内源酶抑制剂处理对指标的影响,以期揭示内源酶对冷藏鲍鱼质构特性的影响规律和机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜皱纹盘鲍,购于大连市甘井子区仟和市场。E-64、1,10-phe和PMSF(蛋白酶抑制剂为生化试剂,仅为实验用途,不可用于水产品保鲜),美国Sigma-Aldrich公司;Bradford蛋白试剂盒,南京建成生物技术有限公司;TA.XT.PLUS型质构仪,英国Stable Micro System公司;JSM-7800F扫描电镜仪,日本东京电子株式会社。

1.2 方 法

1.2.1 原料预处理

鲍鱼快速脱壳后置于冰上放血1 h,在4 ℃下含有0.1 mmol/L E-64、0.1 mmol/L 1,10-phe和1.0 mmol/L PMSF的混合酶抑制剂溶液(E组)中浸泡2 h,水溶液作为空白对照组(C组)。另取一部分放血后的新鲜鲍鱼作为新鲜组(F组)。所有样品在4 ℃贮存1、3、5 d后,取用内收肌部分,并在采样当天立即对质构特性、微观结构和持水能力进行检测。其余样品储存在-30 ℃冰箱中,并在2周内分析其余指标。

1.2.2 鲍鱼的水分含量及持水力测定

水分含量通过直接干燥法测定[6]。称取2～3 g样品放在称量瓶中,在105 ℃干燥箱中恒重4 h后取出,置于干燥器中冷却0.5 h。鲍鱼水分质量分数(w)通过恒重前后鲍鱼的质量差进行计算。

样品的持水力通过高速离心法测定[7]。取4 g样品准确称重(m1),用3层滤纸包裹并置于离心管中,在4 ℃、13 500g离心20 min。离心后取出包裹的滤纸并称量内收肌质量(m2)。计算鲍鱼的持水力。

1.2.3 鲍鱼肌原纤维蛋白的变化

1.2.3.1 肌原纤维蛋白提取

肌原纤维蛋白根据文献[8]的方法提取,稍做修改。取10 g样品与30 mL、10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0,0.1 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EDTA)在冰浴中匀浆,4 ℃、5 000g离心弃上清,重复2次。沉淀用3倍体积0.1 mol/L NaCl均质,并用4层纱布过滤以去除胶原结缔组织和大分子聚集物,滤液于4 ℃、5 000g离心15 min,重复2次,收集沉淀即为鲍鱼肌原纤维蛋白。

1.2.3.2 肌原纤维蛋白溶解性测定

1 g肌原纤维蛋白和100 mL 0.6 mol/L NaCl在冰浴中匀浆,4 ℃下保持2 h。5 000g离心4 min后收集上清液。用双缩脲法测定上清液蛋白质量分数[9]。MP溶解度表示为总蛋白质的质量分数。

1.2.4 水溶性组分分析

将样品和蒸馏水以质量体积比1∶3在冰浴中均质,4 ℃、13 500g离心20 min,收集上清液为水溶性组分。

1.2.4.1 TCA-可溶性寡肽的测定

参考Yvon等[10]的方法测定TCA-可溶性寡肽含量。将6 g样品和6 mL 20% TCA溶液在冰上匀浆,静置20 min后4 ℃、10 000g离心10 min。上清液中TCA-可溶性寡肽含量采用Folin-酚法进行测定。

1.2.4.2 水溶性羟脯氨酸的测定

采用酸水解法测定鲍鱼和水溶性组分中的羟脯氨酸。准确称取水溶性组分0.5 g或鲍鱼样品0.2 g置于安瓿瓶中,加3 mL 6 mol/L HCl,135 ℃下水解4 h。测定560 nm吸光度,用L-羟脯氨酸作标准品绘制标准曲线,根据GB/T 9695.23—2008计算水溶性羟脯氨酸含量。

1.2.4.3 水溶性糖胺聚糖的测定

根据1,9-二甲基亚甲蓝法[11]测定水溶性组分中糖胺聚糖含量。1 mL水溶性组分和3 mL 1,9-二甲基亚甲蓝溶液反应15 min,测定525 nm吸光度,同时用硫酸软骨素标准品绘制标准曲线。

1.2.5 鲍鱼的微观结构

将鲍鱼内收肌修剪成边长约为0.50 cm的正方体,在戊二醛溶液中固定24 h,经乙醇溶液梯度体积分数(50%,60%,70%,80%,90%,100%(第一次)和100%(第二次))脱水处理,真空冷冻干燥,喷金,在扫描电镜下观察微观结构。

1.2.6 鲍鱼质构的测定

采用物性分析仪测定鲍鱼在冷藏过程中剪切力和质地剖面分析(TPA)的变化。将每个鲍鱼内收肌修剪成边长约为1.50 cm的正方体。采用HDP/BS刀片进行剪切力测试。采用P50探头进行TPA测试,测前、测试、测后速率1.00 mm/s,压缩程度75%。

1.2.7 统计学方法

除质构测定(8个平行)外,所有实验操作均采取3个平行实验,结果以(平均值±标准差)表示。采用SPSS 20.0分析学软件中单因素方差(Student-Newman-Keuls模式)进行显著性分析,当P<0.05时认为有统计学的显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 内源酶对冷藏鲍鱼内收肌水分含量及持水力的影响

由图1(a)可知,在冷藏过程中空白对照组和抑制剂组鲍鱼内收肌的水分含量变化不明显,但各组的水分含量均略高于新鲜鲍鱼,这可能是由于浸泡过程中含盐度较高的鲍鱼内收肌吸水造成的。由图1(b)可知,新鲜鲍鱼内收肌持水力为85.61%,随着冷藏时间的延长,持水力呈下降趋势。空白对照组的持水力在冷藏5 d后降至67.72%,这可能是冷藏过程中内源性蛋白酶降解鲍鱼内收肌肌原纤维和结缔组织蛋白,导致持水力降低。相比之下,抑制剂组的持水力在冷藏5 d后仅降至72.88%,表明添加混合抑制剂能够抑制鲍鱼内收肌内源性蛋白酶活性,减少其对组织结构的降解破坏,使鲍鱼内收肌保持较好的持水能力[12]。

(a) 水分质量分数

2.2 内源酶对鲍鱼内收肌蛋白水解的影响

TCA-可溶性寡肽可用于测定肌肉蛋白的降解程度[13]。鲍鱼内收肌冷藏期间的TCA-可溶性寡肽变化如图2所示。随着冷藏时间的延长,TCA-可溶性寡肽含量显著上升,表明冷藏过程中鲍鱼内收肌肌肉蛋白发生降解。冷藏相同时间后,抑制剂组TCA-可溶性寡肽含量均显著低于空白对照组,说明混合蛋白酶抑制剂可以通过抑制酶活力,有效控制蛋白降解。Liu等[12]的研究表明,扇贝柱冷藏过程中,丝氨酸蛋白酶在肌原纤维蛋白和结缔组织蛋白降解中均起到主要作用,而半胱氨酸蛋白酶主要降解肌原纤维蛋白,混合酶抑制剂对蛋白水解的抑制作用优于单一抑制剂。

图2 新鲜及冷藏不同时间鲍鱼内收肌TCA-可溶性寡肽的变化

2.3 内源酶对鲍鱼内收肌肌原纤维蛋白的影响

肌肉蛋白通常分为三大类:肌质蛋白、肌原纤维蛋白和结缔组织蛋白[14],后两类多为水不溶性蛋白。通过测定鲍鱼的MPs提取率和肌原纤维蛋白溶解性来阐明内源性蛋白酶对鲍鱼内收肌肌原纤维蛋白的影响。由图3可知,随着冷藏时间延长,MPs提取率和溶解度呈下降趋势,表明肌原纤维蛋白被内源性蛋白酶降解。冷藏相同时间后,抑制剂组MPs提取率和溶解度均高于空白对照组,表明加入混合蛋白酶抑制剂后,可以控制鲍鱼内收肌中MPs的降解。

(a) 肌原纤维蛋白提取率

2.4 内源酶对鲍鱼内收肌胶原纤维蛋白的影响

通过测定鲍鱼在冷藏过程中水溶性羟脯氨酸和糖胺聚糖含量,以说明内源性蛋白酶对鲍鱼内收肌胶原纤维蛋白的影响。由图4可知,空白对照组的羟脯氨酸溶出率、糖胺聚糖(GAG)溶出量均随冷藏时间延长逐渐升高。羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸,其溶出率增加表明水不溶性胶原蛋白发生降解。GAG是胶原纤维中蛋白聚糖桥接结构的主要构成成分,其释放表明胶原纤维中蛋白聚糖桥接结构的降解[15]。可见,在冷藏过程中,内源性蛋白酶可引起鲍鱼内收肌中胶原成分的降解。冷藏相同时间后,抑制剂组的羟脯氨酸溶出率及糖胺聚糖含量均显著低于空白对照组,这表明混合抑制剂可通过抑制酶活性,减少内源性蛋白酶对胶原纤维蛋白的降解。

(a) 羟脯氨酸溶出率

2.5 内源酶对鲍鱼内收肌微观结构的影响

新鲜鲍鱼内收肌的微观结构如图5(a)所示,平行排列的肌原纤维紧密堆积,纤维之间空隙较小。冷藏3 d后,空白对照组(图5(b))鲍鱼内收肌组织微观结构发生明显变化,表面开始出现大量蛋白质颗粒,可能是胶原结缔组织在冷藏过程中发生降解所致。冷藏第5天时,空白对照组(图5(d))纤维结构排列变得无序且发生断裂,肌原纤维表面的胶原组织逐渐消失,表明内源性蛋白酶降解肌肉蛋白可导致微观结构的变化[16],而抑制剂组(图5(e))表面胶原结缔组织部分保留,肌纤维总体仍然平行排列。说明在冷藏过程中混合抑制剂抑制了内源性蛋白酶对肌原纤维和结缔组织的降解,有助于延缓鲍鱼内收肌的质构劣变。

(a) 新鲜

2.6 内源酶对鲍鱼内收肌质构变化的影响

由图6可以看出,冷藏第1天时,抑制剂组剪切力、硬度、咀嚼度和弹性均高于新鲜样品,这可能是由于鲍鱼内收肌进入到死后僵直阶段[17]。冷藏3 d后,剪切力显著下降,但硬度、咀嚼度、弹性和回复性仍保持稳定,而冷藏至5 d后,所有质构指标均显著下降,说明内源性蛋白酶降解肌肉蛋白,破坏肌肉纤维结构,导致剪切力、硬度、咀嚼度和弹性下降。冷藏1～3 d后,空白对照组样品的剪切力、硬度、咀嚼度和弹性等指标均显著低于抑制剂组,这表明混合酶抑制剂通过抑制内源性蛋白酶活性,在前3天有效控制了鲍鱼内收肌的质构劣变。冷藏5 d后,空白对照组与抑制剂组的剪切力、硬度、咀嚼度和弹性等指标均无显著性差异,这说明加入抑制剂虽可以延缓蛋白降解的进程,但由于肌肉蛋白的持续降解,与空白对照组之间的差异性不再显著。

(a) 剪切力

3 结 论

鲍鱼内收肌在冷藏5 d过程中,内源性蛋白酶降解内收肌中的肌原纤维蛋白和结缔组织蛋白,导致肌原纤维蛋白提取率下降、溶解度降低,TCA-可溶性寡肽、羟脯氨酸和糖胺聚糖溶出增加,破坏微观结构完整性,并降低其持水力,最终导致鲍鱼内收肌质构劣变,表现为剪切力、硬度、弹性、回复性和咀嚼度显著下降。添加半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶的混合蛋白酶抑制剂,可以通过特异性降低各内源性蛋白酶活性,延缓鲍鱼内收肌在冷藏过程中的质构劣变。本研究为可食用酶抑制剂的开发及鲍鱼保鲜加工过程中的质构控制提供了理论支撑。