基于EST-SSR标记的金线莲叶色突变体分子身份分析

樊荣辉 陈艺荃 钟淮钦 叶秀仙

摘要要：【目的】为金线莲（Anoectochilus roxburghii）从DNA分子水平上探索叶色突变体的遗传差异。【方法】采用EST-SSR分子标记技术对金线莲及其2个叶色突变体进行分子鉴定。【结果】20对SSR引物共扩增出78条谱带，其中3对引物（JXL-6、JXL-14和JXL-16）能稳定扩增出差异条带，多态性条带9条，多态性比率11.54％。【结论】获得的2个叶色突变体为金线莲突变体，叶色突变体与亲本在DNA分子水平差异较小。

关键词：金线莲；自然突变；分子标记鉴定；SSR

中图分类号：S567.239                     文献标识码：A                      文章编号：2095-5774（2023）04-0281-05

Identification of Molecular ID of Leaf Color Mutants in Anoectochilus roxburghii

by EST-SSR Molecular Markers

Fan Ronghui1，Chen Yiquan2，Zhong Huaiqin1*，Ye Xiuxian1*

（1Institute of Crop Sciences，Fujian Academy of Agricultural Science/Fujian Engineering Research Center for Characteristic Floriculture，Fuzhou，Fujian 350013，China；

2 Institute of Agricultural Engineering Technology ，Fujian Academy of Agricultural Science，Fuzhou ，Fujian 350003，China）

Abstract：【Objective】 This study aimed to explore genetic differences of leaf color mutants of Anoectochilus roxburghii at the DNA level. 【Method】 Molecular identification of Anoectochilus roxburghii and its two leaf color mutants was conducted by EST-SSR molecular markers. 【Result】 The results showed that 20 pairs of SSR primers produced 78 bands，3 pairs of primers （JXL-6，JXL-14 and JXL-16） could stably amplify differential bands. Nine bands were polymorphic produced in 20 pairs of SSR primers and polymorphism ratio was 11.54%. 【Conclusion】 Two leaf color mutants were identified as mutants of Anoectochilus roxburghii. However，there were small differences between mutants and parents at DNA molecular level.

Key word： Anoectochilus roxburghii；Natural mutation；Molecular marker identification；SSR

突变体，与传统杂交后代相比，具有变异性状多样化、能稳定遗传品种现有优良性状、选育简便快捷等优势，在育种中占有非常重要的地位。因此，突变是丰富种质库的重要途径，也是新品种选育的有效途径。

因环境因素引起的饰变产生的表观遗传同样会影响本种的表型，为明晰所获得的突变材料是否为DNA遗传变异引起，除了进行表型稳定性观测外，还有必要进行遗传鉴定。DNA分子标记技术是以基因组核苷酸的多态性为基础，在分子水平上直接反映遗传变异的标记，具有准确度高、不受环境影响且能早期快速鉴定等优点，广泛用于作物分子辅助育种、遗传多样性分析和品种鉴定等方面［1-4］。目前常用的DNA标记技术有SRAP、RAPD、ISSR、RFLP、AFLP和SSR等［5-8］。SSR是一类由几个核苷酸（一般为1～6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。根据来源不同，SSR分为基因组SSR和植物表达序列标签SSR（ expressed sequence tags SSR，EST-SSR）。EST- SSR标记是基于表达序列标签开发微衛星的一种新型分子标记，因此除了具有基因组SSR的共显性遗传、多态性强、分布随机等优点外，还具有通用性和保守性更强的优点［9］。EST- SSR已广泛用于南瓜（Cucurbita moschata）［10］、铁皮石斛（Dendrobium officinale）［11］等多种作物的品种鉴定和遗传多样性分析。

金线莲（Anoectochilus roxburghii），又名金线兰、金线草等，为兰科开唇兰属多年生草本植物，主要分布在福建、浙江、云南和台湾等地区［12］。具清热解毒、消炎止痛等功效，是中国传统的珍贵药材［13］。金线莲以组培快繁作为主要繁殖方式，在组培快繁过程中较易产生自然突变，本团队在组培过程中获得2个金线莲叶色突变体，具有一定的观赏价值。本研究采用SSR技术对2个叶色突变体进行鉴定，以确定遗传变异的影响因素，并从分子水平上对金线莲新品种选育提供科学依据和参考数据。

1 材料与方法

1.1材料

金线莲母株（J-1）在组培快繁过程中自然突变一株中间金黄色叶色突变体（J-2），中间金黄色叶色突变体（J-2）在组培快繁过程中又自然突变出全金黄色叶色突变体（J-3）（图1）。3个样品在组培瓶中培养3个月，取叶片，液氮速冻，-80℃保存。

1.2基因组DNA提取

金线莲DNA的提取采用CTAB法，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，分光光度计检测DNA浓度，样品浓度调至50 ng/μL，备用。

1.3 SSR 鉴定

使用20对SSR引物对金线莲3个样品进行扩增，引物名称分别为JXL-1至JXL-20。所用引物为转录组测序结果中筛选的SSR引物，转录组原始数据已上传NCBI（NCBI SRA accession PRJNA594793）。PCR反应体系（25 μL）： 10 × PCR buffer 2.5 μL，2.5 M dNTP 2 μL，Taq DNA 聚合酶0.15 μL，10 mM上游引物1 μL，10mM下游引物1 μL，50 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O

17.35 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，适合的扩增产物进一步在全自动核酸蛋白分析仪（ LabChip GX Touch 24，美国 PerkinElmer 公司） 上检测。

2结果与分析

采用20对SSR引物对金线莲母株及2个叶色突变体基因组进行PCR扩增，共扩增出78条谱带，有3对引物（JXL-6、JXL-14和JXL-16）扩增出明亮、清晰、稳定且有差异的条带，用于叶色突变体的鉴定分析，其多态性条带数9条，多态性比率11.54％（表1，图2）。

结果显示，中间金黄色叶色突变体（J-2）与金线莲母株（J-1）的扩增条带相似度很高，只有引物JXL-6和JXL-14能稳定扩增出差异条带，并且多态性条带数少，表明两者在 DNA 分子水平存在较小程度的差异，遗传背景高度相似，也进一步表明中间金黄色叶色突变体（J-2）可能为金线莲母株（J-1）的自然突变体。全金黄色叶色突变体（J-3）是从中间金黄色叶色突变体（J-2）中再次突变而来，分子标记扩增条带表明，二者相似度较高，全金黄色叶色突变体（J-3）与金线莲母株（J-2）相似度稍降低，引物JXL-6、JXL-14和JXL-16均能稳定扩增出差异条带，且多态性条带数目稍多，在 DNA 分子水平上也存在较大差异。聚类分析表明，中间金黄色叶色突变体（J-2）和金线莲母株（J-1）亲缘关系最近，聚为一类，全金黄色叶色突变体（J-3）遗传距离稍远。

3讨论

目前，DNA分子标记技术已成为鉴定作物亲本与后代遗传差异的一种快速、有效和准确的方法。SSR分子标记具有重复性、通用性和稳定性好等优点，在后代鉴定中具有很大优势，已在多种植物中广泛应用［14，15］。

李小孟等（2016）利用SSR引物SS15和TAA27将芽变的真龙柚从沙田柚中鉴别出来，初步确定真龙柚是由沙田柚遗传物质改变产生的［16］。冯涛等（2017）应用SSR分子标记对小白桃及其早熟芽变品种津柳早红基因组DNA进行特异性扩增，找到了UDP96-008、CPPCT 022、BPPCT 028、 UDP98-411、UDP96-99 等5个多态性标记［17］。胡冬梅等（2021）利用SSR技术成功鉴定了温州蜜柑的芽变材料及其亲本［18］。本研究采用SSR标记技术对金线莲母株及2个叶色突变体进行分析，结果表明，中间金黄色叶色突变体与金线莲母株在DNA分子水平上差异很小，遗传背景和亲缘关系更近，可能为金线莲母株的突变体。全金黄色叶色突变体与中间金黄色叶色突变体遗传距离更近，而与金线莲母株相比，遗传距离较远，可能由于全金黄色叶色突变体是从黄绿相间的中间金黄色突变体中再次突变而来，这与其性状表现高度一致。本研究利用全自动核酸蛋白分析仪进行分析，与传统的聚丙烯酰氨凝膠电泳法相比，具有谱带大小准确，灵敏度高和用量小等优点，能更加准确显示遗传差异性。

余周源对小麦39个突变体进行聚类分析，性状相近突变体聚在同一簇下，性状不相近突变体遗传距离稍远［19］。本研究对金线莲母株及2个叶色突变体进行聚类分析，中间金黄色叶色突变体和金线莲母株亲缘关系最近，全金黄色叶色突变体（J-3）遗传距离稍远。此外，本研究为后续相关基因的挖掘，揭示叶色突变机制提供了科学依据。

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（责任编辑：冯新）