基于RAPD分子标记的观赏春石斛遗传多样性分析

刘贝宁 李刘敏 陈发兴

摘要要：【目的】利用RAPD分子标记对观赏春石斛的遗传多样性进行分析。【方法】以10份观赏春石斛种质资源为供试材料，采用100条RAPD随机引物进行筛选。【结果】从筛选出来的15条具有良好多态性的引物中扩增得到125个DNA条带，其中80个条带表现出多态性，多态性位点比率为63.89%。聚类分析结果显示，在相似系数为0.37时10份样本分为两大类，在相似系数0.41时可进一步分为两个亚类群。【结论】利用RAPD分子标记可以鉴别观赏春石斛种质资源。

关键词：春石斛；种质资源；RAPD标记；多态性

中图分类号：S682.31                    文献标识码：A                      文章编号：2095-5774（2023）04-0257-08

Genetic Diversity Analysis of Ornamental Spring Dendrobium Based

on RAPD Molecular Markers

Liu Beining1， Li Liumin2， Chen Faxing2*

（1 International College，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China;

2 College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China）

Abstract：【Objective】 The genetic diversity of Dendrobium was analyzed using RAPD molecular markers. 【Method】 Using 10 ornamental spring Dendrobium germplasm resources as test materials， 100 RAPD random primers were used for screening. 【Result】125 DNA bands were amplified from 15 primers with good polymorphism， of which 80 bands showed polymorphism， and the ratio of polymorphic sites was 63.89%. The results of cluster analysis showed that 10 samples can be divided into two groups when the similarity is 0.37， and further divided into two groups when the similarity coefficient is 0.41. This study can provide theoretical basis for the breeding of ornamental Dendrobium. 【Conclusion】 RAPD molecular markers can accurately identify ornamental spring Dendrobium germplasm resources.

Key Words：Spring Dendrobium；Germplasm resources；RAPD marker；Polymorphism

石斛屬（Dendrobium）为兰科（Orchidaceae）第二大属植物，全球范围内有1400余种［1］。中国石斛属植物有100余种［2］，其中13种为我国特有种，包括铁皮石斛（Dendrobium officinale）和霍山石斛（Dendrobium huoshanense）［3］。石斛属植物包括药用石斛和观赏石斛，药用石斛在我国应用历史悠久，最早记载于东汉时期的《神农本草经》，其在糖尿病、心血管疾病、肿瘤、神经系统疾病等疾病的治疗上应用潜力巨大［4］；观赏石斛有着丰富独特的花型、花色及图案，以及别具一格的花香，受到消费者的青睐。近些年来，石斛产业的发展主要依赖于野生石斛种质资源，石斛新品种的选育较少，且多集中在药用石斛 ［5］。观赏春石斛多作为盆栽供室内观赏，在春节前作为年宵花上市，因其形态雍容华贵，具有高雅尊贵的气质，被人们称为“成功之花”。

分子标记在植物学研究中广泛应用于品种鉴定、遗传关系鉴定、遗传多样性检测、遗传图谱构建等领域［6］。当前已有许多模式植物完成全基因组测序，为分子标记技术的发展奠定基础［7］。目前石斛属的分子标记研究集中在原生种、秋石斛栽培种及药用价值较高的石斛，而尚未见到观赏春石斛相关的研究报道。本研究通过RAPD分子标记技术对10份供试观赏春石斛进行聚类分析，以期进一步评价观赏春石斛种间的遗传多样性，为观赏春石斛种质资源的准确鉴别提供理论依据。

1  材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为10份观赏春石斛种质（表1、图1），由泉州市泉丰生物科技有限公司提供。

参照《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 石斛属》［8］，对供试观赏春石斛表观性状进行观测描述，结果见表2。

1.2 试验方法

1.2.1 观赏春石斛叶片DNA提取

选取观赏春石斛新鲜叶片，采用翌圣生物科技（上海）股份有限公司植物DNA试剂盒提取基因组DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA的提取质量进行观察，检测基因组条带有无及完整性。使用超微量紫外分光光度计测定其浓度、OD260/OD280值，选取OD260/OD280值在1.8～2.0的样品进行后续RAPD-PCR扩增。

1.2.2 观赏春石斛PCR体系优化

根据预实验确定PCR体系为15 μL的体系，其中：模板DNA 3 μL，RAPD引物3 μL，PCRmix酶7 μL，ddH2O 2 μL。选择模板DNA浓度、引物浓度、退火温度3个条件进行单因素梯度优化，各因素水平如表3。

PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸3 min，进行40个循环；72℃延伸6 min。采用1×TAE配制1%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增的产物进行检测，电泳条件为120 V，90 mA，25 min左右，时间根据溴酚蓝指示剂的位置进行控制。

1.3 观赏春石斛遗传多样性分析

本研究使用的RAPD 随机引物 100 条由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。对RAPD-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将清晰可重复的条带记为“1”，将同一位置上的弱带、不重复或没有出现的条带记为“0”。建立“1”、“0”数据矩阵，统计扩增出的总条带数和多态性条带数，计算各个引物的多态性比率。采用Ntsys 2.10e进行聚类分析［8］。

2  结果与分析

2.1 观赏春石斛基因组DNA提取与分析

所有DNA电泳结果如图2所示。电泳结果显示，DNA条带明亮、无杂带和弥散情况，表明得到的DNA完整，没有或较少降解，可在后续用作RAPD标记的模板。

超微量紫外分光光度计测定10份观赏春石斛的DNA浓度及质量结果见表4，由于不同品种石斛之间多糖含量的差异，所提取的石斛基因组DNA浓度差距较大，在42.032～170.406 ng/μL不等，多集中在60～100 ng/μL。OD260 /OD280均在1.8～2.0，进一步表明提取得到的基因组DNA没有或较少降解，纯度较高，可用作RAPD标记的模板。

2.2 观赏春石斛RAPD-PCR体系优化

RAPD-PCR体系中模板DNA浓度优化结果见图3，当DNA浓度为12 ng/μL时，条带相对更加明亮、清晰，数量最多，效果最好。

对引物浓度的优化结果见图4，引物浓度为9 μmol/L时扩增得到的条带数最多、效果最清晰。因此，RAPD-PCR体系的引物浓度选用9 μmol/L。

对退火温度进行优化结果见图5，退火为38.3℃时扩增得到的条带数最多、条带最为清晰明亮。因此，RAPD-PCR体系的退火温度选用38.3℃。

综上分析，观赏春石斛RAPD的最佳反应体系为15 μL的体系包括：9 μmol/L的引物3 μL，

12 ng/μL的模板DNA 3 μL，PCRmix酶7 μL，ddH2O 2 μL。

2.3 观赏春石斛引物多态性分析

先选取表观差异较大的‘泼墨皇后和‘黄金巴比伦对100条随机引物进行筛选，得到20条在这两种石斛中均能扩增得到三条及以上条带数的引物（图6）。进一步筛选得到15个具有良好多态性的引物，从筛选出来的15个具有良好多态性的引物中扩增得到125条DNA条带，每个引物扩增所得的条带数量在6到11之间（见表5）。其中，80条DNA条带表现出多态性，多态性位点比率为63.89%。

2.4 观赏春石斛聚类分析

根据10份观赏春石斛的形态学特征对其进行分类。其中，除‘甜蜜之月和‘红火鸟外其他石斛唇瓣均有眼结构；‘拿坡里、泼墨皇后、‘中华梦和‘樱花美人的萼片及花瓣图案模式均为镶边；泼墨皇后和中华梦之间的性状相似程度最高；黄金巴比伦与红火鸟的花均较小，且花瓣为窄椭圆形，唇瓣图案模式均有网状，与其他8份种质均差别明显。

使用NTsys 2.10e对0，1矩阵进行分析，利用非加权平均法（UPGMA）得到10份观赏春石斛的聚类分析图（图7），在相似性系数为0.37时可以将10份种质分为两大类：第Ⅰ类包括黄金巴比伦和红火鸟，这两份种质花直径均较小，花瓣形状相同，唇瓣图案均具有网状模式，其余石斛种质中没有相同花瓣形状及唇瓣图案；此两份种质的表观性状相似程度高，且与其他8份石斛种质有着明显区别，唇瓣图案具有网状模式，花直径也较小，也是两者独有的表观性状特征。

第Ⅱ类在相似性系数为0.41时又可分为两个亚类群（第Ⅰ亚类和第Ⅱ亚类），第Ⅰ亚类包括‘变异国王、櫻花美人、‘红星，第Ⅱ亚类包括拿坡里、甜蜜之月、泼墨皇后、中华梦和‘红小町。泼墨皇后与中华梦相似度最高，这两份石斛属于观赏春石斛中的泼墨石斛，其花朵的颜色类型和颜色数量十分相似、花瓣与萼片图案模式、唇瓣眼类型与唇瓣图案模式均存在高度相似。变异国王和红星在表观性状上也有着部分相似，唇瓣眼类型及图案模式相同，且与其余供试石斛种质差别明显。因此，RAPD标记显示供试观赏春石斛种质资源间具有丰富的遗传多样性，且可以使用RAPD分子标记对观赏春石斛进行初步分类。

3  讨论与小结

张杨等［9］采用RAPD分子标记技术，对金钗石斛、铁皮石斛和齿瓣石斛等三种石斛进行研究，从分子水平揭示这三种石斛属植物的遗传背景。朱胜男等［10］采用RAPD技术对31种石斛属植物的遗传多样性进行分析，证明RAPD标记技术可以用于石斛属植物的物种鉴定和遗传多样性研究。

本研究10份供试石斛种质均属于观赏春石斛，经过多代杂交获得，亲缘关系较为复杂。崔学强等［11］通过SNP标记的开发将60份供试石斛种质资源分成三个类群，包括本试验的9份种质，其中中华梦和泼墨皇后等2份种质被分入Ⅱ类群，拿坡里、变异国王、红小町、樱花美人、红星、黄金巴比伦和红火鸟等7份种质被分为Ⅲ类群。本研究结果表明中华梦和泼墨皇后品种间相似系数最高、亲缘关系较近，两者在表观性状上也有着高度相似。黄金巴比伦和红火鸟单独分为一类，这与崔学强等［11］的研究结果相符，且黄金巴比伦和红火鸟的花型、花瓣、唇瓣、萼片形状相似，同时与本研究中其他8份种质均有较大差距，黄金巴比伦和红火鸟的唇瓣图案模式具有网状，也是其他8份观赏春石斛不具备的特征。

参考文献：

［1］Pridgeon A M， Cribb P J， Chase M W. Genera Orchidacearum volume 6： Epideudroideae （part 3）［M］. Oxford University Press， 2014：1180-1183

［2］王雁， 李振坚， 彭红明. 石斛兰：资源·生产·应用［M］. 北京： 中国林业出版社， 2007： 11-69.

［3］杨红旗， 李磊， 董薇， 等. 我国石斛植物资源分布及其新品种选育［J］. 中国种业， 2021（12）： 14-21.

［4］Xu Lei， Zeng Xiaoxiong， Liu Yanan， et al. Effect of Dendrobium officinale Polysaccharides on Central Nervous System Disease： Based on Gut Microbiota.［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2023（240）：124440.

［5］杨红旗， 许兰杰， 李磊， 等. 我国石斛新品种选育进展、存在问题及发展对策［J］. 中国种业， 2021（11）： 26-30.

［6］李清， 李标， 郭顺星. 兰科石斛属植物分子生物学研究进展［J］. 中国中药杂志， 2016， 41 （15）： 2753-2761.

［7］王劍锴. 金线莲RAPD-SCAR标记的开发和不同种质遗传多样性评价［D］. 福州：福建农林大学， 2016.

［8］中华人民共和国农业部. NY/T 2758-2015 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 石斛属［S］. 北京： 中国标准出版社， 2015.

［9］张杨， 陈志宽， 赖育菠， 等. 应用RAPD分子标记技术探讨3种石斛属植物的种间关系［J］. 亚热带植物科学， 2014， 43 （2）： 123-126.

［10］朱胜男， 周振华， 冯尚国， 等. 31种石斛属植物的RAPD遗传多样性分析［J］. 杭州师范大学学报（自然科学版）， 2011， 10 （4）： 333-339.

［11］崔学强， 黄昌艳， 邓杰玲， 等. 基于SLAF-seq技术的石斛兰SNP标记开发及亲缘关系分析［J］. 生物技术通报，2023， 39 （6）： 141-148.

（责任编辑：钟海丰）