一例RhD－－缺失型患者的血清学及分子生物学分析∗

水波 侯治兵△ 姚丽 严威 何继武

(1.襄阳市中心血站,湖北 襄阳 441021,2.湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院输血科)

在临床输血领域,人类红细胞抗原的表达和血清中意外抗体的产生都对输血安全产生了较大的影响。除ABO 血型系统中的抗原外,免疫原性最强的要数Rh 血型系统的C、c、D、E、e 抗原,临床检测出的大部分不规则抗体来源于Rh 血型系统。近年来,Rh 血型系统的研究取得了突破性的进展,从血型血清学到分子生物学,积累了大量的经验,并收集了大量研究资料。但Rh 血型系统较为复杂,各种RHCE和RHAG的基因突变及其临床意义还有待进行进一步研究。我们发现了1 例RhD 阳性,C、c、E、e 抗原表达缺失(RHD－－)的患者,现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 患者,女,因三胎足月待产入院,预行剖宫产,手术备血,输血前血清学检测发现存在意外抗体,送入本站。既往于2006 年顺产一子,健存,2020 年8 月因“孕32周、胎盘早剥、死胎”行剖宫取胎术,术中输注去白细胞悬浮红细胞6 U,冷沉淀凝血因子1.75 U,病毒灭活冰冻血浆400 mL,余无特殊。本研究经襄阳市第一人民医院伦理审查委员会伦理审查(2023KYWT02)。

1.2 仪器与试剂 仪器:离心机(KA2200,日本久保田)、离心机(Baso2020-2,江苏贝索)、电恒温水浴箱(H.SWX.600BS,上海新苗)、基因扩增仪(9700,ABI)、测序仪(3130,ABI)。试剂:抗-A、B 标准血清(长春博德,批号:20220906)、ABO 红细胞(批号:20235308)、多特异性抗人球蛋白(批号:20225001)、谱细胞(批号:20230318)、抗-D 标准血清(Baso,批号:V237948),IgM 抗-C 标准血清(批号:20223002)、IgM抗-c 标准血清(批号:20223102)、IgM 抗-E 标准血清(批号:20223203)、IgM 抗-e 标准血清(批号:20223302)均为上海血液生物试剂。RHCE 血型基因分型检测试剂盒(江苏伟禾生物,批号:202207E)、RHAG 血型基因检测试剂盒(江苏伟禾生物,批号:202303G)。

1.3 方法 ABO 正反定型及RhD 定型试验按照«全国临床检验操作规程»进行,Rh 分型试验按照标准血清说明书进行,不规则抗体鉴定采用间接抗人球蛋白法,具体操作按多特异性抗人球蛋白检测试剂盒进行,分子生物学试验采用PCR-SBT 法进行检测,检测依据人类RHCE血型基因分型检测试剂盒及RHAG血型基因分型检测试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 血清学试验 患者为O 型,RhD 阳性,C、c、E、e 抗原均阴性,由于实验室无C、c、E、e 抗原的确认试剂,未进行吸收放散试验。不规则抗体鉴定10 谱细胞均为阳性,新生儿Rh表现型为CCDee。

2.2RHCE基因测序 经与参考序列比对发现,第1 外显子的48 位碱基由G 变为C(c.48G>C),第2 外显子的150 位碱基由C 变为T(c.150C>T)、178 位碱基由C 变为A(c.178C>A)、201 位碱基由A 变为G(c.201A>G)、203 位碱基由A 变为G(c.201A>G)、307 碱基由C 变为T(c.307C>T),第5 外显子的676 位表现为G。患者RHCE基因型为RHCE∗02/RHCE∗02,即红细胞抗原表现型应为CCDee。见图1。

2.3RHAG基因测序 经与参考序列比对发现,第6 外显子的808 位碱基由G 变为A(c.808G>A)、861 位碱基由G 变为A(c.861G>A)。见图2。

图2 RHAG 外显子测序结果图

3 讨论

Rh 血型系统是除ABO 血型系统外,抗原性最强、且最具多态性的血型系统[1]。在输血领域,ABO 血型同型输注后,Rh 血型系统引起的输血不良反应占主导地位。Rh 血型抗原基因包括RHD和RHCE,二者是紧密连锁、高度同源的基因,其同源性高达96%～97%[2]。广泛的单核苷酸多态性和遗传重组,从而导致变异性Rh 抗原的产生[3]。随着分子生物学技术的发展,Rh 抗原表达的多态性得到进一步的解释,上百种变异性血型抗原得以发现。研究发现,Rh 血型抗原的表达不仅受RHD/CE基因的控制,同时受调节RHAG基因的影响,当RHAG基因发生突变,则可能导致RHAG基因表达的调节蛋白质发生变化,RHAG基因不能正常表达,造成RHD/CE 蛋白不能正常穿膜,导致RH 血型抗原无法激活,从而使血型抗原无法表达于红细胞表面[4-5]。

RhD 缺失型,即红细胞上的C、c、E、e 4 种抗原均不表达,但D 抗原正常表达或过量表达,是极为罕见的变异型。研究发现,RHD 缺失型产生的原因分2 种,一是RHCE基因变异导致的抗原无法正常表达,二是抗原正常表达但RHAG基因突变导致抗原不具有活性[6]。RHAG 与RHD/CE 虽然属于不同的血型系统,但两者密切相关[7-8]。本文中的患者有3 次孕产史,并在第2 次怀孕32 周发生胎停,行剖宫产手术过程中发生大出血,有输血抢救史。本次怀孕足月待产,预行剖宫产术,在术前输血相容性检测过程中发现其表现型为RHD－－(实验室条件受限,无法进行C、c、E、e4 中抗原的确认试验),且血浆中存在不规则抗体,该抗体与10 个谱细胞均发生凝集反应。遂行基因检测,发现该患者RHCE基因型为RHCE∗02/RHCE∗02,即红细胞抗原表现型应为CCDee。但该患者抗原缺失,于是怀疑可能存在调节基因RHAG的突变。经DNA 测序发现在RHAG基因第6 外显子的808 位点和861 号位点存在G>A 的突变(其中861 号位点G>A 的突变,ISBT 库暂未公布其相关信息,可能为1 个新突变位点),据此怀疑该患者RHCE 抗原缺失与RHAG基因6号外显子2 个位点的点突变相关,即抗原正常表达但不具有抗原活性。患者RhD 抗原正常检测,是否因位点突变不影响其表达或对表达的影响不足以影响血清学试验,还有待进一步考证。患者血浆中检测出的抗体与抗原C、c、E、e 均发生凝集反应,但是否为抗-Hro 还有待进一步考证。

Rh 血型系统的复杂性和在输血领域的重要性,应引起重视。有报道[9-10]称,RHAG基因沉默导致Rh 抗原不表达,称为Rhnull 型,RHAG基因弱表达,则Rh 抗原弱表达,称为Rhmod 型。该患者RhD 抗原表达正常,只有RHCE 抗原缺失,应属于Rhmod 型。RhD－－表现型虽然极为罕见,但其引起的输血困难不可小觑。由于红细胞膜表面抗原的缺失,在接受输血、妊娠等免疫后,可产生多种不规则抗体,且该抗体仅与RhD－－、Rhnull 和Rhmod 不发生溶血性输血反应[11],很难找到与之配合的血液。妊娠则会导致胎儿新生儿溶血病,严重的可能导致死胎[12]。该患者在第2 次怀孕时就出现了胎停。临床治疗过程中,血液制剂目前无可替代品,在大出血紧急抢救中起着极为重要的作用。为了保护用血患者的安全,做好输血前相容性检测,不漏检抗体和(或)抗原,同时联合分子生物学技术,正确鉴定患者的血型。输血后进行不规则抗体筛查,以便及时预防和监测溶血反应的发生[13]。

综上所述,建议针对该类患者:1)未产生不规则抗体的患者,减少不必要抗原免疫性刺激,减少免疫性抗体产生,有助于保障临床用血的安全。2)不规则抗体筛查能有效筛查出患者血液中的不规则抗体,从而减少或避免各种溶血性输血反应的发生,提高临床输血的安全性[14],做好检测,已产生不规则抗体存在的患者,能不输血则不输,择期手术备血的患者可采用自体输血的方式,满足其手术中需要的用血,紧急输血的患者,可以先利用血浆置换术减少患者体内的抗体滴度后,再输注红细胞类血液制剂。3)对妊娠期妇女规范开展不规则抗体检测及管理,可在孕产妇输血、宫内输血或新生儿换血时予以特殊指导[15]。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。