新冠病毒抗体ELISA 筛查假阳性反应:不同方法检测结果的内在逻辑∗

王立林 李然 李彤 张爱佳 刘衡 许晓绚 曾劲峰 邬林枫

(深圳市血液中心,广东 深圳 518035)

2020 年初至2023 年5 月,新型冠状病毒感染(coronavirus disease 2019,COVID-19)一直是影响全球的突发公共卫生事件。随着研究的深入和疾病检测诊断经验的积累,血清学检测方法对公共卫生的意义引发更多关注。2020 年3 月«新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)»在原有核酸检测和测序基础上增加“血清学检测”作为确诊依据[1]。但是,不同的实验室检测诊断方法适应于特定的时间、环境和人群,不同条件下检测结果也会大相径庭。在COVID-19 流行早期,低流行率的人群出现较高的抗体假阳性率[2-4],影响抗体筛查对疾病的诊断和流行防控功能。这种情况在流行率显著低于试剂的假阳性率时更加突出[5]。已知流行率不变,提高试剂特异性能减少假阳性,降低误诊率。

新发再发传染病流行初期,当暂未有新一代灵敏特异试剂可供选择,未有更先进的仪器设备可以使用,如何最大限度鉴别假阳性标本是检验人员需要思考的问题。本研究探索在无偿献血人群中,通过多种方法对筛查出来的抗体反应性标本进行确证,分析不同方法的有效性和可行性,谨慎地对假阳性人群进行甄别,真正将疫情防控在初期,同时避免不必要的假阳性困扰。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 新冠抗体反应性组 2020 年3 月28 日至4 月28 日,8 632 人次(8 505 名)献血者新冠抗体ELISA 筛查反应性标本设为阳性组(PC 组),其追踪血浆标本为FC 组。反应性献血者及其追踪的血浆标本分装,－20℃冻存。献血者已通过«献血者健康检查要求»的问询。本研究获得深圳市血液中心伦理委员会批准(批件号SZBC-2020-R013),献血者已签署知情同意书。

1.1.2 疾病对照标本组 2020 年1 月30 日至4 月7 日,30名在深圳市血液中心捐献血浆的新冠康复者血浆标本作为疾病对照组(DC 组)。

1.1.3 阴性对照标本组 采用系统随机抽样方法,抽取2020年2 月2 日至4 月27 日,165 例新冠总抗体阴性标本作为阴性对照组(NC 组)。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 血液筛查常规血清学检测 HBsAg 试剂1(DiaSorin S.p.A.UK Branch),HBsAg 试剂2(北京万泰生物药业股份有限公司),抗-HCV 试剂1(Ortho-Clinical Diagnostics),抗-HCV试剂2(珠海丽珠试剂股份有限公司),HIV Ag-Ab 试剂1(BIO-RAD),抗-HIV 试剂2(北京万泰生物药业股份有限公司),抗-TP 试剂1(DiaSorin S.p.A.UK Branch),抗-TP 试剂2(珠海丽珠试剂股份有限公司)。

1.2.2 SARS-CoV-2 血清学检测 采用北京万泰生物药业股份有限公司生产的新型冠状病毒总抗体检测试剂(批号:NCOA20200204B、NCOA20200306B)、新型冠状病毒IgG 抗体检测试剂(批号:NCOG20200306B)、新型冠状病毒IgM 抗体检测试剂(批号:NCOM20200205B)。新型冠状病毒刺突蛋白S1 结构域的受体结合域(receptor binding domain,RBD 蛋白,35 KD)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N 蛋白,47 KD)的重组蛋白购自义翘生物。实验室合成新型冠状病毒受体结合蛋白(3 倍体RBD 蛋白,60-110 KD)。辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG 二抗(索莱宝生物)。

1.2.3 血液筛查核酸检测 Procleix Ultrio Elite 检测试剂,Procleix HIV-1、HCV、HBV Discriminatory Assay 鉴别试剂(Grifols,西班牙),MPX v2.0 HBV、HCV、HIV(1＋2 型)PCR-荧光法NAT 联合检测试剂(罗氏,美国),Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 test,version 2.0(罗氏,美国)。珀金埃尔默(PerkinElmer)新型冠状病毒核酸检测试剂盒(RT-PCR)(提取试剂批号:SBM20200301,扩增试剂批号:AY20200204/AY20200406)。

1.2.4 仪器 诺华全自动NAT 平台(PROCLEIX Tigris System,美国诺华),美国罗氏诊断公司cobas s 201 核酸CAP/CTM 检测系统,由全自动混样仪(HAMILTON Microlab STAR IVD,瑞士HAMILTON),核酸提取仪(cobas AmpliPrep)与分析仪(cobas TaqMan)组成。珀金埃尔默(PerkinElmer)高通量explorerTMG3 全自动新冠病毒核酸检测系统。FAME24/20 酶联免疫检测仪器(瑞士HAMILTON),Xantus 酶联免疫加样仪器(深圳爱康),酶标仪(TECAN sunrise)。垂直电泳仪(165-8003)、电转仪(170-3930)、凝胶成像系统(BIO-RAD Gel Doc XR＋) 、半干转仪器(1704150)均为美国伯乐。

1.3 方法

1.3.1 ELISA 方法检测试验流程及判定规则 应用检测总抗体(total antibody,TAb)的ELISA 试剂筛查献血者血浆,采血1 月后随访TAb 反应性献血者。对TAb 阳性献血者标本及随访标本补充IgG、IgM 项目检测及pVNT 项目检测。操作方法和结果的判定均按照试剂说明书执行。抗体试剂检测值与CUTOFF 比值大于1.0 经双孔复试,复试中有1 孔CUTOFF 比值大于1.0 则判为反应性,复试均阴性则判定为阴性。

1.3.2 pVNT 此部分试验委托厦门大学公共卫生学院完成[6]。应用慢病毒包装质粒(psPAX2,Addgene＃12260)、SARS-CoV-2 S 蛋白表达质粒(含有来自MN908947.3 菌株密码子优化的S 蛋白基因)和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)报告载体构建针对SARS-CoV-2 S 抗原(spike antigen) 的假型化慢病毒 (lentiviral pseudotype particle,LVpp)。选取H1299-ACE2hR 细胞进行感染及中和试验。首先,LVpp 与连续稀释总抗体阳性血浆(1 ∶10、1 ∶40、1 ∶160、1 ∶640、1 ∶2560、1 ∶10240)共同孵育1 h,孵育后,将上述血浆混合物100 μL 加入96 孔板细胞中,共培养36 h 后,应用Operetta CLS 高通量仪器(PerkinElmer)成像观察。采用Columbus软件2.5.0(PerkinElmer)定量测定mNeonGreen(＋)细胞荧光,最后,比较阴性血浆对照孔与总抗体阳性试验孔mNeon-Green(＋)细胞减少率(%),对应中和活性。通过4 参数logistic(4PL)回归确定每个标本的pVNT ID50(maximal dilution ratio at half-infection inhibition,ID50)值,即达到50%感染抑制所需的最大稀释倍数。ID50>30 为判定中和抗体阳性的临界值。采用此种方法制备成的假病毒有且仅有新冠病毒的外膜蛋白,其感染易感细胞完全依赖新冠病毒外膜蛋白介导,且能被识别新冠病毒外膜蛋白的特异性抗体所阻断中和。

1.3.3 Western Blot 方法检测新冠特异性抗体 将商品化新冠N、S 重组蛋白以合适浓度免疫转移至0.45μm 孔径硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,简称NC 膜)上。所有待确证血浆加入电泳缓冲液TBST,以1 ∶40 体积比稀释,与转印有重组蛋白的NC 膜室温孵育3 h,PBST 洗3 次,每次8 min。NC 膜在1 ∶5 000 倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG 二抗中,室温孵育2 h,PBST 洗3 次,每次8 min。膜条采用辣根过氧化物酶底物DAB(3,3-二氨基联苯胺四氢氯化物)显色。新冠N、S 重组蛋白相应分子量区带均显色判为阳性,单独N、S 重组蛋白条带显色为可疑阳性。

1.3.4 追踪随访 采血1 月后追踪TAb 阳性献血者,问询高危因素,采集血液检测pVNT 及TAb、IgM、IgG 抗体、WB。采用系统随机抽样的方法,随机抽取总抗体阳性的献血者进行随访。

1.4 统计学分析 pVNT 试验阳性反应和随访总抗体阳性反应,并且满足pVNT 和IgG 同时阳性反应的标本才被判定为真阳性。

2 结果

2.1 DC 组和NC 组标本的验证试验结果 新冠康复者血浆(DC 组)TAb、IgG 全部(30/30)、pVNT、WB 方法学均呈阳性反应,IgM 有93.33%(28/30)呈阳性反应。总抗体、IgG、IgM检测的S/CO 值的±s 分别为15.30±1.94、13.8±3.79、12.21±10.67,pVNT 的半数感染抑制最大稀释率ID50 范围为30～1 378 910,±s 为72.55±2 447.42。新冠WB 试验结果见图1,其中1～8 为NC 组标本,全部为阴性结果,9～18 为DC 组标本,N 蛋白条带全部为阳性,1×RBD 蛋白条带全部为阳性,3×RBD 蛋白条带除9 号、14 号标本略弱,其余全部为阳性。

图1 不同组血浆标本新冠WB 试验结果

2.2 PC 组及FC 组标本及其追踪标本检测结果 8 632 人次献血者标本新冠核酸结果均阴性,检出TAb 阳性献血者34 名,其中,IgG 阳性5 名,IgM 阳性8 名,pVNT 试验阳性4例,WB 试验阳性2 例。1 个月后成功追踪其中26 名,TAb 阳性献血者21 名,其中,IgG 阳性献血者4 名,IgM 阳性献血者2名,pVNT 试验阳性2 例,WB 试验阳性2 例。结果见表1,2。

表1 新冠抗体ELISA 筛查34 例反应性标本不同项目检测结果

2.3 PC 组中pVNT 阳性标本及其追踪标本的一般信息 PC组中有4 例pVNT 阳性,追踪TAb＋标本中有2 例pVNT 阳性,均与2 例WB 阳性标本重合。7 号和18 号标本追踪IgG的S/CO 值未升高,不符合抗体动态变化规律。7 号标本及其追踪WB 试验仅N 条带阳性。18 号标本的追踪pVNT 检测转为阴性,两者WB 试验各条带均无反应。12 号和33 号追踪标本IgG 的S/CO 值升高、IgM 值降低,符合抗体动态改变。12 号标本的追踪pVNT 检测也转为阴性,但WB 一直为多条带阳性。33 号标本及其追踪pVNT 及WB 结果一致阳性(表3)。

3 讨论

准确评估一般人群中新冠病毒抗体的流行率对控制流行病非常重要,但假阳性反应结果会影响对流行病的评估。新冠流行早期,部分SARS-CoV-2 抗体试剂缺乏同时针对刺突蛋白(S1、S2)和核衣壳蛋白的检测能力[7],pVNT 和其它中和试验也会产生假阳性反应。如何在新发再发传染病大流行伊始,在诊断试剂尚未优化提升时,最大限度甄别ELISA 抗体筛查中假阳性标本,不仅是对献血人群的人文保护和尊重,更是为政策制定部门科学决策,控制疫情爆发于未然提供强有力的支持。

本研究中使用的总抗体主要是针对刺突蛋白S1 亚基的RBD 区设计,可以最大限度地检测疑似标本。IgG 血清学检测可以用于检测既往感染。文中1 个月后对献血者检测TAb 和pVNT 均呈阳性反应,理论上在出现病症的中位数14 d 就可以检测到对病毒特异的IgG[8]。但是,即使最好的检测试剂,第一类错误和第二类错误都是无法避免的。美国食品和药品管理局(FDA)建议,如果流行率较低,试验室应使用“正交测试算法”(即依次采用两个独立检测方法)来确认阳性检测结果。2020 年3—4 月,深圳地区流行率较低,人群归属低危级别。此期间,8 632 人次深圳地区献血者血浆中筛查出34 例TAb 反应性,2 例pVNT 试验阳性、初次筛查和随访总抗体和IgG 均阳性,WB 结果阳性,可判定为真阳性,真阳性率只有0.024%。与费雷等[9]以及广州和其他国家和地区[10-14]的研究相比,深圳研究期间的真实流行率是非常低的。确证方法、流行阶段以及初筛试剂性能都会显著影响真实阳性率[4]。人群高流动性对新冠疫情的监测造成了巨大威胁,深圳采取了严格的疫情防控和检疫隔离政策,为控制新型冠状病毒感染传播发挥了重要作用[12]。采取严格疫情防控地区人群从理论上讲是低危人群,也导致了深圳普通人群抗体检测较高假阳性率。

本文对献血人群中初次筛查出的PC 组及其随访标本,检测了新冠特异性IgG、IgM、pVNT 以及新冠WB。在检测之前,研究首先通过检测PC 组标本对试验方法进行验证。DC组标本TAb、IgG、pVNT、WB 检测结果均一致,试剂性能初步判断可作为随后的确证依据。其中WB 方法为实验室内部建立,优势在于:在NC 膜上转移多个病毒特异性抗原,观测病毒蛋白特定大小区域条带是否有反应,检测相应病毒特异性抗体,类似于人类免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)抗体的确证试验。判定这类病毒学验证的实验室内部方法,早在2003 年非典后就有报道[15]。图1 中,使用了新冠特异性N 蛋白,1×RBD 蛋白,3×RBD 蛋白,若某种蛋白在低危人群中假阳性率较高,但多个病毒特异性蛋白同时检测,规定多个蛋白均有反应判为阳性,可提高诊断的特异性,大幅减少假阳性反应。

在非SARS-CoV-2 感染患者甚至健康对照组的血清标本中,已经发现有假阳性反应或交叉反应现象,涉及多种因素。首先,β 冠状病毒与SARS-CoV-2 的血清学交叉反应,是基于它们的蛋白质具有同源性序列。SARS-CoV-2 和非典型肺炎病毒(SARS-CoV)具有高度同源性(同源性76%,相似性87%),其次是中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)和人冠状病毒HKU1(HCoVHKU1),均与SARS-CoV-2 高度同源。多项研究发现SARSCoV-2 和SARS/MERS-CoV 抗体之间的交叉反应最强,这是因为它们的刺突蛋白之间的序列和结构同源性最高[16,17]。SARS-CoV-2 抗体可以识别出暴露在病毒衣壳表面的4 种SARS-CoV-2 蛋白中的3 种:包括核衣壳(N)、包膜(E)、刺突(S)蛋白[8]。SARS-CoV-2 S 蛋白是由S1 和S2 亚基组成,分别介导附着和进入靶细胞。有研究报道SARS-CoV-2 S2 亚基和N 蛋白中比S1 亚基有更多的保守的抗原表位,最终导致在人冠状病毒阳性患者血清中有更多的交叉反应[10,18]。然而,另1 项研究报道,“普通感冒”相关的人类季节性流感病毒(比如HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU-1、HCoVNL63)与我们的检测并不会引起明显的交叉反应[19]。本研究表1 和表2 中多种检测方法对ELISA 检测结果结果不一致的原因,可能与使用的检测分析系统差异或者被调查的人群不同有关,所以更加凸显探索新发再发传染病确证方法的意义[20]。

表2 新冠抗体ELISA 筛查反应性标本26 例追踪标本不同项目检测结果

表3 中,因TAb 阳性PC 组中4 例pVNT 阳性标本及FC组2 例pVNT 阳性标本,均与2 例WB 阳性标本重合,所以列表分析这4 例标本的特点。结果发现,18 号标本的追踪pVNT 检测转为阴性,PC 组和FC 组两标本WB 试验各条带均无反应,考虑到TAb 的S/CO 值并不高,IgG 始终阴性,推测本研究中pVNT 试验也存在假阳性情况。7 号标本及其追踪标本IgG 均阴性,尽管pVNT 检测结果均为阳性,但考虑到WB 试验仅N 条带阳性,同时问卷调查中该献血者近期有EB 病毒感染史,推测该标本pVNT、WB 试验结果受影响导致假阳性。12 号和33 号追踪IgG 的S/CO 值升高、IgM 值降低,综合pVNT、WB 试验结果符合抗体动态改变,所以判定为真阳性标本。本研究认为在新发再发传染病大流行伊始,应综合多种诊断试剂结果,病毒特异性pVNT 中和抗体主要用于监测免疫反应和疫苗效价,多条带WB 试验结果用于判断多种抗体产生情况,同时依据抗体动态演变规律,结合人群流行率和人口流动情况,共同确证ELISA 抗体筛查中假阳性标本。

表3 pVNT 阳性标本及其追踪情况

此外,除了考虑病毒特征性抗体演变逻辑和宿主免疫外,问卷调查也有助于提高我们对疾病传播的了解。但是,由于本研究标本数量有限,筛选出的阳性样品数量较少,所以,虽然有一定的结果但不能完全通过结果来断定其结论,会有很多未知潜在干扰因素导致假阳性反应。今后需要在更大数量的标本中,进行深入细致研究,以提高新发再发病原体抗体监测的准确性。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。