分散固相萃取-超声波辅助提取叶菜型甘薯液中黄酮化合物的方法优化

2024-01-03王和寿

农业开发与装备 2023年11期

王和寿

（1.宁德市农产品质量安全检验检测中心，福建宁德 352100；2.农业农村部南方薯类科学观测实验站，福建福州 350013）

0 引言

叶菜型甘薯是以藤蔓茎尖生长点及其以下10～15 cm的茎段作为蔬菜食用的甘薯专用类型。中国预防医学科学院研究表明，与芹菜、番茄、菠菜等13种蔬菜相比，其蔓尖部分蛋白质、维生素、铁等13项营养物质含量均位居首位，而且在茎叶部位富含多酚、黄酮类物质[1]。黄酮化合物是叶菜型甘薯中重要的一类具有生物活性的次级代谢产物，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等生物活性[2]，在叶菜型甘薯研究中备受关注。传统黄酮化合物提取方法主要有浸渍法、煎煮法、热回流提取法等，但这些方法提取过程大多比较繁琐，提取液和残渣分离麻烦[3]，一定程度上减缓了富含黄酮化合物的优质叶菜型甘薯选育进程以及叶菜型甘薯中黄酮化合物的研究。所以，建立一种简便、快捷的叶菜型甘薯中黄酮化合物的提取方法十分必要。

随着提取技术的发展，酶提取法、微波萃取技术、超声波辅助提取法等新手段被应用于植物中黄酮的提取。超声波提取法是利用超声波破坏植物细胞壁和细胞膜，加速细胞质中黄酮化合物溶出，从而达到更有效的提取。该方法具有提取率高、操作简便，并且对黄酮化合物结构不会造成损害等优点。分散固相萃取方法是一种用于农产品中农药残留检测的快速样品前处理技术。该方法具有回收率高、分析速度快、污染小、操作简便等优势，被广泛应用于农药、兽药残留的检测中。本文结合超声波辅助提取技术和QuChERS方法，对甘薯叶片中主要的芦丁、异槲皮苷、二氢槲皮素、斛皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等7种黄酮化合物进行提取[4]，对料液比、提取试剂浓度及超声提取时间进行优化，以期建立一种简便、快捷、有效的叶菜型甘薯中黄酮化合物的提取方法。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

试验材料选用的叶菜型甘薯品种为福菜薯18，由福建省农业科学院作物研究所提供。

1.2 仪器与药品试剂

1.2.1 仪器。三重四级杆质谱仪LCMS8050（日本岛津制作所），超纯水机Direct-Q5（德国默克公司），冷冻离心机3-18KS（德国默克公司），超声波清洗仪KQ-500E（昆山市超声仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱DHG-9245A（上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.2.2 药品试剂。净化剂C18，40～63 μm；芦丁、异槲皮苷、二氢槲皮素、斛皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等标准溶液，纯度均在99.99%以上；甲醇、乙腈为色谱级。上述药品均购于上海安谱科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理。将田间获得的样品经干燥、粉碎、过筛（100目筛）制备成甘薯叶粉末。称取0.2 g甘薯叶粉末，置于10 ml离心管中，加入10 ml甲醇+水（80+20，v+v），并充分漩涡振荡。于60℃水浴超声20 min，5 000 r/min，离心5 min。吸取2 ml上清液于10 ml离心管内，往管内加入0.2 g的C18净化剂，充分振荡后，5 000 r/min，离心3 min。吸取1 ml上清液过0.45 μm滤膜，待上机测定。

1.3.2 色谱条件。色谱柱：C18（2.1 mm×100 mm）。流动相：（A）水和（B）乙腈。梯度洗脱程序：0～1 min，80%A；1～3 min，80%A～50%A；3～6 min，50%A～10%A；6～7 min，10%A；7～7.1 min，10%A～80%A；7.1～9 min，80%A。流速：0.4 ml/min。柱温：40℃。进样体积：5 μl。雾化气流量：3L/min。接口温度：350℃。

1.3.3 质谱条件。叶菜型甘薯中芦丁、异槲皮苷、二氢槲皮素、斛皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等7种黄酮化合物的质谱条件（表1）。

表1 各黄酮化合物质谱条件

1.4 数据处理

式中，ω为黄酮化合物的得率（%）；

C为待测溶液中某黄酮化合物的浓度（ng/ml）；

F为稀释因子；

V为定容体积（ml）；

M为样品的质量（g）。

利用SPSS.19对文中数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 最佳料液比的筛选

按照1.3.1的试验方法，分别精确称取0.05 g、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.6 g、1.0 g叶菜型甘薯干粉，加入10 ml甲醇+水（80+20，v+v），用于检测不同料液比下各黄酮化合物的得率。试验结果发现，福菜薯18中不含有二氢槲皮素，另外6种黄酮化合物的得率随着料液比的增加，均呈现先增加后降低的趋势。其中，芦丁和异槲皮素在料液比达到0.2 g/10ml时，得率达到最高，分别为2.16 μg/g、16.27 μg/g。槲皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚在料液比为0.1 g/10ml时，得率最高，依次为0.012 μg/g、0.37 μg/g、0.27 μg/g、0.13 μg/g。从6种黄酮化合物总量来看，当料液比为0.2 g/10ml时，总黄酮得率达到最高，为18.93 μg/g（表2）。因此，选择0.2 g/10ml作为黄酮化合物提取的最佳料液比。

表2 不同料液比对各黄酮化合物得率的影响（μg/g）

2.2 最佳甲醇浓度的筛选

按照1.3.1的试验方法分别检测60%、70%、80%、90%、100%甲醇含量对黄酮化合物得率的影响。试验结果发现，当甲醇浓度逐渐增加时，芦丁等黄酮化合物的得率均随之增加，当甲醇浓度达到80%时，芦丁等黄酮化合物测的含量最高，依次为2.914 μg/g、16.279 μg/g、0.0096 μg/g、0.406 μg/g、0.0257 μg/g、0.128 μg/g（表3）。继续增加甲醇浓度，芦丁、异槲皮素、槲皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等黄酮化合物得率开始下降，降幅分别达到13.21%、14.37%、24.69%、12.56%、19.84%、6.25%。因此，选择80%甲醇浓度为最佳试验条件。

表3 不同提取浓度对各黄酮化合物得率的影响（μg/g）

2.3 最佳超声时间的确定

按照1.3.1的试验方法，分别考察10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min超声时间对不同黄酮化合物得率的影响。当超声提取时间为20 min和60 min时，芦丁、槲皮素、槲皮苷、柚皮素、山奈酚5种黄酮化合物的得率高于其他试验组，这两组所测得的得率差异不显著（p＞0.05）。槲皮素的得率随着超声提取时间的延长呈现逐渐增加的趋势，在60 min时测得的得率最高，为0.57 μg/g。从6种黄酮化合物总量来看，在20 min时黄酮得率达到23.69 μg/g，高于30 min时，但与40 min、50 min、60 min测得的总黄酮得率差异不显著（p＞0.05）（表4）。综合考虑提取效率，选择提取时间20 min时为最佳试验条件。

表4 不同超声时间对各黄酮化合物得率的影响（μg/g）

2.4 验证试验

按照1.3.1试验方法，在料液比0.2 g/10ml、甲醇体积分数80%、超声时间20 min条件下进行验证试验。试验结果表明，芦丁、异槲皮素、槲皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚、总黄酮的得率依次为3.01 μg/g、13.87 μg/g、0.0102 μg/g、0.375 μg/g、0.023 μg/g、0.124 μg/g、17.532 μg/g。